一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用。其制备方法包括以下步骤：1）构建mdproPO1/pET‑30a重组表达载体；2）筛选高表达MdproPO1重组蛋白的表达菌株mdproPO1/pET‑30a/Rosetta；3）表达菌株的发酵培养与诱导表达；4）MdproPO1包涵体的变性与复性。该法用大肠杆菌表达系统生产出的家蝇酚氧化酶原（MdproPO1）表达量高，通过原核菌体回收、破碎，可以获得大量的MdproPO1包涵体，通过MdproPO1包涵体的变性与复性，可以获得可溶的有酶活性的MdproPO1重组蛋白。MdproPO1重组蛋白可以发展为灭蝇剂、氧化剂、黑化剂以及免疫剂，应用到卫生、保健、生物与化工等多个领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用，属于基因工程

技术介绍
家蝇是广布全球的卫生害虫，可以传播细菌、病毒和寄生虫等上百种病原体，但其自身却能够良好的生存，这完全得益于家蝇有一个强大的先天免疫系统。昆虫缺乏获得性免疫，对入侵病原的防御完全依靠先天免疫。昆虫的先天免疫包括细胞免疫和体液免疫两部分。细胞免疫主要指血细胞对病原的包被、吞噬等作用；体液免疫指抗菌因子如抗菌肽的产生和黑化作用等。其中的黑化作用是由酚氧化酶原激活系统(prophenoloxidase-activatedsystem，proPO系统）完成。proPO系统是昆虫免疫体系的重要成员，对病原入侵能做出最快速的免疫应答，不仅影响黑色素合成，还影响昆虫的发育与寿命，并与抗菌肽产生有关，在识别与防御病原中起关键作用。通过几个昆虫proPO系统的研究，发现proPO系统的激活是一个丝氨酸蛋白酶级联反应：上游的丝氨酸蛋白酶水解下游酶的酶原，活化的酶再去激活下一个酶的酶原，最终将酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）激活为酚氧化酶（phenoloxidases，PO）。PO是proPO系统中最后的也是最重要的功能组分，能将酚氧化成苯醌，进而形成不溶性的黑色素。一般，PO以无活性的proPO存在于血细胞里。proPO基因在昆虫中广泛存在，如埃及按蚊有10个，果蝇有3个，家蚕与烟草天娥各有2个，而蜜蜂只有1个。昆虫proPO基因的多样与其参与机体黑化、伤口愈合、血细胞聚集和表皮鞣化等多种功能有关。但是，目前对家蝇有几个proPO基因以及这些proPO基因重组的蛋白具有什么样的功能还不清楚。通过转录组分析，发现家蝇有2个proPO基因，称其为mdproPO1与mdproPO2，具体见论文[DianxiangLi，YongliLiang,XianweiWang,LeiWang,MeiQi,YangYu,YuanyuanLuan.TranscriptomicanalysisofMuscadomesticatorevealkeygenesoftheprophenoloxidase-activatingsystem.G3(Bethesda).2015;5(9):1827-1841.(SCI)]。mdproPO1基因含有一个开放阅读框（ORF），编码的MdproPO1蛋白无信号肽，有典型的保守区：一个酪氨酸酶保守区，一个硫酯基序保守区，一个酚氧化酶原激活酶（proPO-activatingenzyme，PAP）裂解位点，两个结合铜离子的保守区（每个保守区都有三个组氨酸残基，可与铜离子以共价键结合，两个铜离子与氧原子结合）。但是，并不清楚MdproPO1蛋白是否具备被蛋白酶水解为活性MdPO1的功能，更不知道其具体的功效。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种利用原核表达系统生产的可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白，同时，提供了其应用。本专利技术的技术方案为：扩增mdproPO1基因的开放阅读框（ORF）cDNA片段，构建mdproPO1/pET-30a重组表达载体，表达MdproPO1重组蛋白，进行开发应用。表达载体的构建：依据家蝇mdproPO1基因ORF的两端序列和载体pET-30a的多克隆位点，设计一对上下游引物mdproPO1ExF与mdproPO1ExR，并在引物的5’端引入KpnI与SalI酶切位点，用大肠杆菌（Escherichiacoli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）混合液诱导的家蝇幼虫的cDNA为模板，PCR钓取mdproPO1片段，利用KpnI与SalI两个酶切位点，与pET-30a载体定向连接，构建mdproPO1/pET-30a表达载体，经测序证明该表达载体中的mdproPO1序列正确。家蝇MdproPO1完整的核苷酸和推断的氨基酸序列：atgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgMHHHHHHSSGLVPRGSGMaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccKETAAAKFERQHMDSPDLGTatgactgacaaaaagaatctcctgttgctgttcgaccgccccaccgaaccggtgttcatgMTDKKNLLLLFDRPTEPVFMggaaagggcaaaacatcgacggtcttcgatgttcccgacaagtacttgacaaaacgttacGKGKTSTVFDVPDKYLTKRYgaacgtttgggcaatgaaatccaaagtcgtttcggcgaaaaggctgaacaacgtgtaccgERLGNEIQSRFGEKAEQRVPgttaggggaatatccctgcccgatttacgtattcccatgtccttgggtcgtgatgaacaaVRGISLPDLRIPMSLGRDEQttctcattgttcgtgccacgtcatcgtcgcattgcgggtcgcttgattgacattttcgttFSLFVPRHRRIAGRLIDIFVggcatgcgcaccgttgatgatttgctcagtgttgctgtgtatgcccgtgatcgtgtcaatGMRTVDDLLSVAVYARDRVNccctatttgttcaattatgccctctcggtggctttgttgcatcgcgaagataccaagggtPYLFNYALSVALLHREDTKGttggatttgccctcgtttgcccagaatttccccgataagtttgtggattcccaggtcttcLDLPSFAQNFPDKFVDSQVFcgtcaggtgagagaggaagccacagtcgtgcccgatggatctcgcatgccaattgtagttRQVREEATVVPDGSRMPIVVcctcgtgactataccgcttccgatttggatcccgaacatcgtctgtggtatttccgtgagPRDYTASDLDPEHRLWYFREgatatgggcatcaatcttcatcactggcattggcatttggtttatcctttcgaggctgggDMGINLHHWHWHLVYPFEAGgatcgccgtattgtcgagaaggatcgtcgcggtgaacttttctattacatgcatcaacagDRRIVEKDRRGELFYYMHQQgtcattgcccgctacaacatggaacgtttcagcagcaatttggcccgtgtcactagattcVIARYNMERFSSNLARVTRFaacaacttccgtgaacccattgctgaaggttatttccccaagatggattcactggttgccNNFREPIAEGYFPKMDSLVAagccgtgcttggccaccacgtttcgataatactcccatcaaagatttgaatcgtgaattgSRAWPPRFDNTPIKDLNRELgatcaaatcaatttggac本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：1）构建mdproPO1/pET‑30a重组表达载体；2）获得mdproPO1/pET‑30a/Rosetta高表达MdproPO1蛋白的表达菌株；3）表达菌株的发酵培养与诱导表达，获得MdproPO1包涵体；4）MdproPO1包涵体的变性与复性，获得可溶的有活性的MdproPO1重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：1）构建mdproPO1/pET-30a重组表达载体；2）获得mdproPO1/pET-30a/Rosetta高表达MdproPO1蛋白的表达菌株；3）表达菌株的发酵培养与诱导表达，获得MdproPO1包涵体；4）MdproPO1包涵体的变性与复性，获得可溶的有活性的MdproPO1重组蛋白。2.根据权利要求1所述的家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1）构建mdproPO1/pET-30a重组表达载体：用大肠杆菌Escherichiacoli和金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus混合液诱导的家蝇幼虫的cDNA为模板，依据家蝇酚氧化酶原基因的核苷酸序列，合成一对扩增该基因ORF的原核表达特异引物，引物序列为：mdproPO1ExF：5‘—TAGatcGGTACCATGACTGACAAAAAGAATCTCC—3’mdproPO1ExR：5‘—TAGGTCGACGCTGGCTGGAGAAAACTTAT—3′该引物包含KpnI与S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李殿香，于洋，栾园园，王蕾，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37