一种利用全基因组测序进行分离鉴定与精细定位水稻农艺性状基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用全基因组测序进行分离鉴定与精细定位水稻农艺性状基因的方法，首先利用回交获得目标性状分离的3‑6代回交群体，选取目标性状差异最大的两个单株分别进行重测序，对测序结果中的杂合位点进行比较分析，筛选出目标性状候选位点；再利用回交F2群体连锁分析进行QTL分离鉴定与精细定位。本发明专利技术的方法能快速准确的鉴定并精细定位水稻QTLs，为其进一步的克隆与功能分析打下坚实基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及遗传育种
，特别涉及一种利用全基因组测序进行分离鉴定与精细定位水稻农艺性状基因的方法。
技术介绍
在农业作物里，许多农艺性状都是由一个或多个基因调控的。尤其是一些重要农艺性状，往往都是由几个基因共同调控，这些基因被称之为数量性状位点(quantitativetraitloci，QTLs)。QTLs同样控制着许多水稻重要性状，尤其是一些产量相关的农艺性状。因此鉴定和分离QTLs一直是水稻研究的重点方向。目前，在水稻中已有许多QTLs被定位，但只有其中的一小部分被克隆，缺乏高效的QTLs克隆方法是其中一大制约因素。常规的QTLs克隆方法主要是图位克隆法，首先利用初级群体(F2或RIL)对目标性状的QTLs进行初步定位，确定主效QTL及其两侧分子标记；利用回交并结合分子标记辅助选择获得遗传背景单一且表型稳定的高世代回交后代(BCnF1)，再筛选目标区域杂合的近等基因系，构建NIL-F2群体进行精细定位，获得候选基因。在这一过程中获得遗传稳定的回交后代及双亲在该QTL区间内的多态性是能否成功克隆到QTL的关键。传统的QTL定位方法费时费力，且对材料间的多态性要求甚高。随着DNA测序技术的发展，全基因组测序(Whole-genomesequencing,WGS)越来越多地被应用到植物基因的定位与克隆当中。WGS首先是被用于分析基因组间的遗传多态性，随后通过测序获得的丰富的遗传多样性被应用于全基因组关联分析(genome-wideassociationstudies,GWAS)。随着一些模式植物的基因组序列被组装完成后，以这些基因组为参照序列的第二代测序技术(next-generationsequencing,NGS)在基因的定位与克隆，尤其是QTLs的发掘上发挥了重要作用。测序获得的高密度遗传多态性大大提高了QTLs定位的精度。利用NGS结合分离群体分组分析法(Bulked-segregantanalysis，BSA)方法，已分离鉴定多个拟南芥突变体基因和一些水稻的QTLs。而在此基础上发展的QTL-seq技术，更为QTLs的快速准确定位提供了新的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用全基因组测序进行分离鉴定与精细定位水稻农艺性状基因的方法，该方法能快速准确的鉴定并精细定位水稻QTLs，为其进一步的克隆与功能分析打下坚实基础。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用全基因组测序进行分离鉴定与精细定位水稻农艺性状基因的方法，(1)以目标性状具有差异的两份水稻材料为亲本进行杂交，再以一方亲本为轮回亲本进行连续回交，获得目标性状分离、目标性状控制基因位点有且仅有杂合和轮回亲本两种基因型的3-6代回交F1群体；(2)选取3-6代回交F1群体中目标性状差异最大的两个单株分别进行全基因组重测序，或选取3-6代回交F1群体中与轮回亲本在目标性状上差异最大的单株及该轮回亲本分别进行全基因组重测序；(3)以区间内杂合态多态的分布频率为统计指标，对步骤(2)全基因组重测序结果中的杂合位点进行比较分析，获得两份水稻材料间在杂合位点分布频率具有显著差异的区段，选取携带目标性状的测序单株中的杂合位点频率显著大的区段为调控目标性状的候选基因区段；(4)参照步骤(3)序列分析结果，在调控目标性状的候选基因区段设计引物，再利用步骤(2)测序的回交F1群体中目标基因为杂合型的单株自交产生的F2群体作为图位克隆群体，对候选基因区段与目标性状间的连锁关系进行分析，对控制目标性状的基因位点进行分离鉴定与精细定位。作为优选，步骤(1)中的回交选择带有隐性性状一方亲本为轮回亲本进行回交，每代回交都选取带有显性性状的单株为父本。作为优选，步骤(4)中在调控目标性状的候选基因区段每1000kb-3000kb设计一对引物。本专利技术的有益效果是：方法不仅能快速准确的鉴定并精细定位水稻一个或多个主效数量性状基因，同时也可分离鉴定多个互作基因位点，为进一步的克隆与功能分析打下坚实基础。附图说明图1是本专利技术的技术路线图；图2是比较各世代材料的表型。a：水稻大粒品种KSHJ,小粒品种HZ及其F1的籽粒比较；b：BC4F1中大粒单株(LG)与小粒单株(SG)在粒型上的差异；c：SG与LG成熟期表型图。图3大粒材料与小粒材料在差异杂合位点分布频率的比较结果。图4大粒基因的关联分析及精细定位。图5BC4F1中光叶亲本与长茸毛单株测序结果杂合区段分析。图6叶毛发生相关基因LH5与LH6的定位。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例：材料与方法：水稻材料：两组带有不同性状差异的水稻被用来验证试验方法。其中一组为粒型有明显差异的水稻品种况丝华巨(KSHJ，大粒籼稻品种)和华占(HZ，小粒籼稻品种)，以华占为轮回亲本进行连续回交，获得BC4F1群体，从该群体中选取一大粒单株及一小粒单株作为测序样本；另一组为叶片表面带长茸毛的水稻籼稻品种菲B10和光叶美国稻品种Cypress，以Cypress为轮回亲本进行连续回交，获得BC4F1群体，从该群体中选取一叶表面长茸毛单株及轮回亲本Cypress作为测序样本。本专利技术使用的所有种质资源均由中国水稻研究所种质资源库提供。基因组DNA样品的备制及测序：四份测序样品的DNA用DNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)提取，每份样品大约10ug高纯度DNA被用于后续测序。所有的测序工作和前期的数据预处理，包括去除无效数据，去除接头序列等均由杭州联川生物技术有限公司完成。序列的比对分析：以网上提供的水稻基因组序列为参照序列(http://ensembl.gramene.org/Oryza_indica/Info/Index和http://plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Location/)，将测序样本的序列分别与之进行比较，分别得到两者与参照序列具有差异的位点。对以上差异位点进行归类分析，可分为两者间相同或不同的差异位点。再选取两者特有的差异位点中的杂合位点进行分析，以区间内杂合态多态的在染色体上的分布频率为统计指标，比较两份样品的统计结果，获得两份水稻材料间在杂合位点分布频率具有显著差异的区段，将带有目标性状样品的杂合位点显著多于另一样本的染色体区段作为控制目标基因的候选区段。目标基因的定位分析：参照序列分析结果，在候选区段内设计引物，以BC4F1为定位群体，对检测到的差异序列与目标性状进行关联分析，确定目标基因所在的位点。以目标性状分离的BC4F2大群体为精细定位群体，对目标基因进行精细定位。结果与分析本专利技术的基本原理本专利技术中用到的定位与克隆水稻农艺性状基因的方法如图1所示，该技术结合了全基因组测序和传统QTLs定位克隆方法，可快速准确地定位水稻农艺性状基因，并为水稻农艺性状基因的克隆及功能分析打下深厚的材料基础。首先我们选取目标性状有差异的两份材料进行杂交，选择带有隐性性状一方亲本为轮回亲本进行回交，每代回交都选取带有显性性状的单株为父本。如果调控目标性状的基因为单个基因或一主本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用全基因组测序进行分离鉴定与精细定位水稻农艺性状基因的方法，其特征在于：(1)以目标性状具有差异的两份水稻材料为亲本进行杂交，再以一方亲本为轮回亲本进行连续回交，获得目标性状分离、目标性状控制基因位点有且仅有杂合和轮回亲本两种基因型的3‑6代回交F1群体；(2)选取3‑6代回交F1群体中目标性状差异最大的两个单株分别进行全基因组重测序，或选取3‑6代回交F1群体中与轮回亲本在目标性状上差异最大的单株及该轮回亲本分别进行全基因组重测序；(3)以区间内杂合态多态的分布频率为统计指标，对步骤(2)全基因组重测序结果中的杂合位点进行比较分析，获得两份水稻材料间在杂合位点分布频率具有显著差异的区段，选取携带目标性状的测序单株中的杂合位点频率显著大的区段为调控目标性状的候选基因区段；(4)参照步骤(3)序列分析结果，在调控目标性状的候选基因区段设计引物，再利用步骤(2)测序的回交F1群体中目标基因为杂合型的单株自交产生的F2群体作为图位克隆群体，对候选基因区段与目标性状间的连锁关系进行分析，对控制目标性状的基因位点进行分离鉴定与精细定位。

【技术特征摘要】
1.一种利用全基因组测序进行分离鉴定与精细定位水稻农艺性状基因的方法，其特征在于：(1)以目标性状具有差异的两份水稻材料为亲本进行杂交，再以一方亲本为轮回亲本进行连续回交，获得目标性状分离、目标性状控制基因位点有且仅有杂合和轮回亲本两种基因型的3-6代回交F1群体；(2)选取3-6代回交F1群体中目标性状差异最大的两个单株分别进行全基因组重测序，或选取3-6代回交F1群体中与轮回亲本在目标性状上差异最大的单株及该轮回亲本分别进行全基因组重测序；(3)以区间内杂合态多态的分布频率为统计指标，对步骤(2)全基因组重测序结果中的杂合位点进行比较分析，获得两份水稻材料间在杂合位点分布频率具有显著差异的区段，选取...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪深，朱旭东，肖文斐，陈红旗，王跃星，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33