一种灰霉病菌拮抗菌株及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物技术及生物防治领域，具体涉及一种解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA‑KA4及其筛选方法和应用。本发明专利技术从土壤中分离出细菌，采用平板对峙法从中筛选出对黄瓜灰霉菌（Botrytis cinerea）的抑制率为65%且稳定遗传的细菌BA‑KA4。经菌株的培养特征、形态和生理生化特征结合16S rDNA 序列和gyrB基因序列结果分析，菌株BA‑KA4初步鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloloquefaciens。保存菌种，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.12190，其对黄瓜灰霉病的防治效果最好且持效期长，具有广泛的抑菌谱。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物技术及生物防治领域，具体涉及一种解淀粉芽胞杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）BA-KA4及其筛选方法和应用。
技术介绍
灰霉病是一种世界性的植物病害，该病害由半知菌亚门真菌—灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引发，侵染包括黄瓜、西红柿、葡萄等多种作物，对农业生产构成极大威胁，严重影响蔬菜和水果的产量和质量。目前主要采用嘧霉胺、嘧菌酯、多菌灵、乙霉威、速克灵等化学农药进行防治，化学农药的大量使用，不仅造成了环境污染，而且引起了灰葡萄孢菌对嘧霉胺、多菌灵、乙霉威等药剂的抗药性，王美琴等研究表明，山西晋中地区黄瓜灰霉病菌对乙霉威和速克灵的抗性达到中抗，对多菌灵的抗性为高抗。李兴红等研究发现，北京地区番茄灰霉病对嘧霉胺的抗药性非常普遍，且以高抗菌株为主，生产上应替换新型杀菌剂防治番茄灰霉病。所以，开发安全、高效、不引起抗性的生物防治途径是降低灰霉病危害、减少环境污染、保证农业稳产高产的重要途径，越来越成为灰霉病防治的研究热点。目前，已经筛选出多株对灰葡萄孢菌有拮抗作用的菌株。Elad将哈茨木霉T39菌株制成哈茨木霉可湿性粉剂用于控制温室作物和葡萄灰霉病等病害的发生。Dik等比较了哈茨木霉T39和出芽短梗霉、浅白隐球酵母对黄瓜和番茄灰霉病的防治效果，发现哈茨木霉和出芽短梗霉处理能使茎部病斑与植株的死亡率降低40%~100%，其防效优于杀菌剂对甲抑菌灵和扑海因。魏艳敏等测定了26株放线菌菌对5种病原真菌的抑菌作用，其中5株对灰霉病病菌抑菌作用较强，抑菌活性明显高于50%多菌灵等对照化学药剂。韩斯琴等从长白山土壤中分离到了一株放线菌D2-4，经平板抑菌试验、离体叶片试验和盆栽试验发现该菌的发酵液对番茄灰霉病病菌具有很强的抑制和防治效果。迄今为止，用于灰霉病防治研究和应用的细菌有10多种，主要有芽胞杆菌、假单胞菌等，可控制番茄、辣椒、草莓、苹果和葡萄等植物灰霉病的发生和危害。童蕴慧等分离获得的拮抗性强、抗菌谱广的地衣芽胞杆菌Wl0、W3、Y2-11-1菌株，对番茄灰霉病叶片和果实的防效为70%~80%，优于50%速克灵2000倍液。王伟等研究发现拮抗细菌x-75对番茄灰霉病具有较好的抑制效果。总体来说，我国利用拮抗细菌防治灰霉病的研究还相对很少，王英国等人中分离到1株解淀粉芽胞杆菌，其对于尖孢镰刀菌、草莓蛇眼病菌等植物病原真菌均有很强的抑制作用。王奕文等人首次从甜瓜果实表面分离到1株解淀粉芽胞杆菌，对灰葡萄孢、链格孢、尖孢镰刀菌、黑曲霉和粉红单端孢等果蔬采后病原真菌具有显著且广谱的拮抗作用。本研究利用单一靶标初筛、多靶标复筛的筛选体系，从土壤样品中筛选出了对灰霉病拮抗效果良好、且抑菌谱较广的解淀粉芽胞杆菌BA-KA4，以期为灰霉病的生物防治提供材料支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种编号为BA-KA4的解淀粉芽胞杆菌，其具有可抑制作物灰霉病病原菌的生长的作用，且抑菌谱较广，尤其具有可明显抑制黄瓜灰霉病病原菌的生长的作用。另一方面本专利技术还提供了上述菌株的筛选方法和用途。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案为：一种灰霉病菌拮抗菌株，该菌株为解淀粉芽胞杆菌BA-KA4，于2016年3月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.12190。进一步地，所述的灰霉病菌拮抗菌株，具有抑制辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌生长的活性。一种上述解淀粉芽胞杆菌BA-KA4的筛选方法，包括以下步骤：（1）对来自不同地区的土壤试样中的细菌进行分离纯化与保藏；（2）初筛：采用平板对峙法进行拮抗菌的筛选，用直径5mm的打孔器在黄瓜灰霉病菌边缘打孔，将菌块接种于PDA平板中央，挑取4个不同的单菌落均匀接在距离指示菌3cm的位置，22℃黑暗培养5d后，观察抑菌效果，选出具有抑菌圈的菌株进入复筛；（3）复筛：以黄瓜灰霉病菌为指示菌，采用十字交叉法将进入复筛的菌株点接在距平板中央3cm处的4个角上，平板中央同时移入直径5mm的长有灰霉病菌的琼脂块，22℃黑暗培养5d后，观察抑菌结果，测定抑菌圈直径，计算抑菌率，筛选出抑菌率60%以上的菌株；进行继代培养，测定遗传稳定性，筛选培养10代后抑菌率60%以上的菌株；选择辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌作为指示菌,采用平板对峙法对选出的菌株进行抑菌谱的测定，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径，计算抑菌率，筛选出对这8种真菌抑菌效果都较好的菌株，即为解淀粉芽胞杆菌BA-KA4。进一步地，步骤（1）的具体操作为：从云南、黑龙江、新疆、河北地区采来的120个土壤，采用PB培养基，利用稀释涂平板方法进行土壤分离，于28℃培养箱中培养3d后，挑取菌落形态不同的细菌进行5次划线纯化、编号，并采用15%的甘油在-80℃冰箱保存。进一步地，所述PB培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15g，pH7.4，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。一种上述解淀粉芽胞杆菌BA-KA4在防治作物灰霉病害中的应用。进一步地，其防治方法为用无菌水将解淀粉芽胞杆菌BA-KA4稀释成浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，121℃灭菌20min后，叶面喷施于作物。本专利技术所述的解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.12190的形态学特征为：在PB培养基上生长不产生色素，菌落扁平或圆形、乳白色不透明、菌落边缘整齐，表面有褶皱。革兰氏阳性，显微镜观察为杆状、产生芽孢，芽孢椭圆或柱形。参见图3。参照《柏杰明细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》进行菌株的生理生化鉴定，结果如表1所示，初步鉴定拮抗菌BA-KA4为解淀粉芽胞杆菌。表1拮抗菌生理生化鉴定结果注：“+”表示阳性，“-”表示阴性本专利技术的解淀粉芽胞杆菌BA-KA4对辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌等多种病原真菌均具有明显的抑制作用；并且尤其适用于制作为农用制剂用于防治作物灰霉病菌感染而引起的病害。生物样品保藏信息解淀粉芽胞杆菌BA-KA4，分类命名为Bacillusamyloliquefaciens，已于2016年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNo.12190。附图说明图1拮抗菌BA-KA4对黄瓜灰霉病菌的拮抗效果图2拮抗菌BA-KA4抑菌谱图3拮抗菌BA-KA4菌落形态图4拮抗菌BA-KA4依据16SrDNA基因序列的系统发育树图5拮抗菌BA-KA4依据gyrB基因序列的系统发育树。具体实施方式本专利技术中所用供试土壤为从云南、黑龙江、新疆、河北等地采集的土样。供试病原菌为辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌，由本实验室分离保存。供试黄瓜种子购于河北省农科院。供试培养基为：P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灰霉病菌拮抗菌株，其特征在于，该菌株为解淀粉芽胞杆菌BA‑KA4，于2016年3月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 12190。

【技术特征摘要】
1.一种灰霉病菌拮抗菌株，其特征在于，该菌株为解淀粉芽胞杆菌BA-KA4，于2016年3月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.12190。2.根据权利要求1所述的灰霉病菌拮抗菌株，其特征在于，具有抑制辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）、小麦赤霉病菌（Fusariumgraminearum）、小麦纹枯病菌（Rhizoctoniacerealis）、烟草赤星病菌（Alternariaalternata）、大蒜菌核病菌（SclerotiniaalliiSaw）、番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）、番茄早疫病菌（Alternariasolani）、梨黑斑病菌（Alternariaalternate）生长的特性。3.一种权利要求1-2任一项所述解淀粉芽胞杆菌BA-KA4的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：（1）对来自不同地区的土壤试样中的细菌进行分离纯化与保藏；（2）初筛：采用平板对峙法进行拮抗菌的筛选，用直径5mm的打孔器在活化的灰霉病菌边缘打孔，挑取菌块接种于PDA平板中央，挑取4个不同的单菌落均匀接在距离指示菌3cm的位置，22℃黑暗培养4-6d后，观察抑菌效果，选出具有抑菌圈的菌株进入复筛；（3）复筛：以灰霉病菌为指示菌，采用十字交叉法将进入复筛的菌株点接在距平板中央2-3cm处的4个角上，平板中央同时移入长有灰霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昆昂，黄亚丽，贾振华，马宏，宋聪，赵芊，黄媛媛，刘方，张立文，宋水山，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13