一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术公开了一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法。所述的人子宫内膜癌细胞系保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12290。建立方法的步骤：(A)获取新鲜的临床子宫内膜癌手术切除标本，采用II胶原酶消化法进行细胞分离原代培养；(B)当细胞汇合度达90％左右时，进行细胞传代培养，完成hEMC20121018的建系。本发明专利技术的人子宫内膜癌细胞系具有稳定的细胞生物学特性，高表达HER‑2基因编码蛋白，且在哺乳动物体内体内能够形成肿瘤。可直接应用于细胞生物学、分子生物学、抗肿瘤药物筛选等相关重要研究，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人子宫内膜癌细胞系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物细胞领域，特别涉及一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法。
技术介绍
子宫内膜癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤之一，子宫内膜癌在美国、欧洲等发达地区。目前已接近新发妇科恶性肿瘤的50％，据美国国家癌症研究所报道，2015年美国子宫内膜癌的新发病例54870例，死亡10170例。虽然发展中国家子宫内膜癌的发病率低于发达国家，但其死亡率34％(21000/62000)显著高于发达国家21％(29000/136000)。子宫内膜绝大多数为腺癌，多见于更年期与绝经后妇女。由于子宫内膜癌的发病机制及侵袭转移仍不十分清楚，目前尚无有效的预防方法，对于晚期及不能耐受手术的病人，没有特异性的化疗、放疗方案，患者预后差。所以，建立多种不同生物学特性的子宫内膜癌细胞系是深入开展子宫内膜癌研究的基础。目前，已知的子宫内膜癌细胞系多于20世纪60-80年代建立，如Ishikawa细胞系和HTB111，HTB112，HTB113，CRL-95等，收录在美国组织细胞培养库(ATCC)。KeiichiIsaka等从1名50岁低分化子宫内膜癌病人的手术标本建立一株细胞系EN，伴有P53突变。HEC-1-A及其亚株HEC-1-B是H.Kuramoto等人于1968年从一位IA期子宫内膜癌患者身上分离获得，PAF可诱导HEC-1-A细胞c-fos的表达，HEC-1-B细胞在培养第135天到190天之间，表现出稳定的生长周期，且重现扁平，与亲本细胞系相比，更具铺路石式样，其主要染色体组是亲本细胞的两倍。1997年，岱美茹等报道了国内第一个正式建立的子宫内膜腺癌细胞系HEC-D，为子宫内膜癌生物学研究提供了体外模型。吴中明等用1名65岁IV期中度分化子宫内膜腺癌病人的腹水内癌细胞培养成功，建立JEC细胞系。Fuijaswa等从一高分化子宫内膜腺癌病人和一中度分化内膜腺癌病人标本分离出两株不同的细胞系HEC-251和HEC-252。Hasegawa等获得一来源于未分化内膜癌的细胞系TMG-1。但是，随着细胞系体外传代次数的增多，其一些特有的生物学特征会逐渐改变或消失。例如，Ishikawa高分化内膜样癌细胞系，来源于一名39岁女性患者，雌孕激素受体阳性，细胞生长无雌激素依赖性，已建系20余年，得到了广泛的应用。但是随着培养时间的延长，Ishikawa细胞逐渐去分化，细胞形态向未分化性状转变，因此，不断建立新的细胞系，具有重要的意义。现有的人子宫内膜癌细胞系存在的生物多样性低，与临床上子宫内膜癌的生物学性状相差较大等不足。但肿瘤细胞系为研究肿瘤生化、代谢、免疫及细胞调控提供很好的模型，所以，建立新的子宫内膜癌细胞系，将为研究子宫内膜癌提供良好的研究材料，将进一步促进子宫内膜癌的基础和临床研究。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供一种新的人子宫内膜癌细胞系及其建立方法和应用。本专利技术所提供的人子宫内膜癌细胞，名称为人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018，简称hEMC1018，并于2016年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12290。所述的人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018，性状稳定，可传100世代，成瘤率高，潜伏期短，均一性好，可直接用于进行细胞学实验、抗肿瘤药物筛选和体外建立动物模型等相关重要研究，是应用于基础研究和临床前期的理想人子宫内膜癌细胞系。所述的人子宫内膜癌细胞优选为中-低分化腺癌。所述的人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018的生物学特性，其特征在于：具有稳定的细胞生物学特性，瘤细胞贴壁生长，代谢旺盛，生长快速，并可重叠生长，具有良好的体外培养扩增性；具有稳定的克隆形成能力和迁移、侵袭能力；细胞系高表达HER-2基因编码蛋白；细胞系在哺乳动物体内能够形成肿瘤，致瘤性强，可成功制备子宫内膜癌发生、发展的动物模型，该动物模型可用于研究子宫内膜癌发生发展分子机制、药物筛选及发现子宫内膜癌相关新生物标志等，是人子宫内膜癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。所述的哺乳动物为本领域常规的哺乳动物，优选为BALB/C-nu/nu裸小鼠。所述的人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018对多西他赛和顺铂具有稳定的敏感性。为了实现上述目的，本专利技术还提供一种人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018的建立方法，包括如下步骤。步骤(A)获取新鲜的临床子宫内膜癌手术切除标本，采用II胶原酶消化法，进行细胞分离原代培养。步骤(B)当细胞汇合度达90％左右时，进行细胞传代培养，完成hEMC20121018的建系。所述步骤(A)的具体方法如下。(1)标本组织的处理：将新鲜离体组织浸润于RPMI-1640培养液；用PBS液冲洗组织标本，处理组织后，再用PBS液大量冲洗组织后，反复剪切组织至糊状，加入胶原酶II型。(2)消化反应：将步骤(1)的组织置于含5％CO2，37℃的培养箱中进行消化处理，每隔20min用移液器吹打消化中的组织；加入含10％胎牛血清的混合培养基进行中和，静置培养数分钟。(3)离心、培养：收集步骤(2)得到的消化液的上层液体进行离心处理，弃上清液，用混合培养液悬浮细胞团后，接种于培养瓶中，置于5％CO2，37℃的培养箱中静置培养；换液时，吸出旧培养基，用PH为7.4的PBS清洗培养瓶，加入含10％胎牛血清的混合培养基，置于5％CO2，37℃培养箱中，静置培养，备用。所述的RPMI-1640培养液含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的双抗，且含10％胎牛血清。所述步骤(B)的具体方法如下。(1)细胞悬浮、离心：吸弃进行原代培养的培养瓶中的培养液，用含双抗的PH为7.4的PBS液清洗培养瓶；加入含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化液，使细胞消化液100％覆盖细胞培养瓶底；置于5％CO2,37℃培养箱中，静置培养2-3分钟；加入与消化液等量混合培养基进行中和，吹打培养瓶，吸出细胞悬浮液，离心。(2)换液、培养：取步骤(1)离心处理的细胞液，弃上清液，加入细胞培养液，重悬细胞，将细胞悬液加入新的培养瓶，置于5％CO2，37℃培养箱中，静置培养，当细胞传代至第十代以后，将培养液更换为RPMI-1640培养液，得到所述的子宫内膜癌细胞系hEMC20121018。所述的PBS液的原料组成及用量为含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的双抗、NaCl8.5g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.85g、KH2PO40.27g，1000ml蒸馏水，PH7.4。所述的细胞培养液为RPMI1640与DMEM/F12按1:1比例混合(各占50％)。所述的混合培养基为RPMI-1640培养液和DMEM/F12培养液按1:1比例混合(各占45％)，以及10％胎牛血清。本专利技术的有益效果。1.本专利技术的人子宫内膜癌细胞系是从人子宫内膜癌组织中获得，性状可稳定传代至100世代以上。应用细胞生物学、肿瘤病理学及分子肿瘤学等相关实验方法，可以对该细胞系的生物学行为进行了全面评估，发现该细胞系具有稳定的体外增殖、无限传代能力、克隆形成能力和侵袭、转移能力，且在裸小鼠体内具有较强的致瘤性，成瘤率高，皮下和腹腔成瘤率为66.67％，潜伏期短(28天)，均一性好。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人子宫内膜癌细胞系，其特征在于，所述的人子宫内膜癌细胞系保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12290。

【技术特征摘要】
1.一种人子宫内膜癌细胞系，其特征在于，所述的人子宫内膜癌细胞系保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.12290。2.如权利要求1所述的人子宫内膜癌细胞系,其特征在于，所述的人子宫内膜癌细胞为分化腺癌。3.如权利要求1所述的人子宫内膜癌细胞系的生物学特性，其特征在于，具有稳定的细胞生物学特性，高表达HER-2基因编码蛋白，且在哺乳动物体内有能够形成肿瘤。4.如权利要求3所述的人子宫内膜癌细胞系的生物学特性，其特征在于，所述的哺乳动物为BALB/C-nu/nu裸小鼠。5.如权利要求1所述的人子宫内膜癌细胞系的用途，其特征在于，可以应用于细胞生物学、分子生物学、抗肿瘤药物筛选的研究。6.如权利要求1-5所述的人子宫内膜癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(A)获取新鲜的临床子宫内膜癌手术切除标本，采用II胶原酶消化法进行细胞分离原代培养；(B)当细胞汇合度达90％左右时，进行细胞传代培养，完成hEMC20121018的建系。7.如权利要求6所述的人子宫内膜癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤A中的原代培养为：将新鲜离体组织浸润于RPMI-1640培养液；用PBS液冲洗组织标本，修剪组织，去除坏死组织，再用PBS液大量冲洗组织后，反复剪切组织至糊状，加入浓度为1mg/ml的胶原酶II型；置于含5％CO2，37℃的培养箱中进行消化1h，用移液器吹打消化中的组织；加入等量的含10％胎牛血清的混合培养基进行中和，静置培养数分钟；收集上层消化液进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛彦，孟丽荣，孙丹，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，澳門理工學院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21