与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物及其检测方法和应用技术

本发明专利技术属于分析化学及临床医学领域，公开了与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物及其检测方法和应用。该标志物为尿液雌激素代谢物2‑甲氧雌二醇和/或雄烯二酮，采用UPLC‑Q exactive MS方法检测，该标志物可用于特发性男性不育的辅助诊断与监测，具有较高的灵敏度和特异度，具有临床推广价值。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术属于分析化学及临床医学领域，涉及与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物及其基于UPLC-QexactiveMS的检测方法和应用。
技术介绍
目前，全球约有10-15％的育龄夫妇患有生育障碍。我国由于人口基数大，新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万，其中男性因素导致的不育高于50％。男性不育中目前仍有约40％～75％找不到原因，称为特发性男性不育症。特发性男性不育造成了极为严重的疾病负担。事实上，特发性男性不育诊断存在很大难度。男性不育的WHO的诊断标准是夫妻婚后同居1年以上，未采取避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者。然而，由于现实原因很多夫妻并不能保证严格的同居1年，使得最后的男性不育判断变得非常困难；同居长达1年的观察时间，大大耽误了对男性不育进行早期治疗和干预的时间；为了排除女方原因，女方还需要进行详细的检查，带来了沉重的经济和医疗负担。现有的男性不育相关检查依赖的是传统的精液常规检查，它只关注精子数量、运动度、精液量、pH和液化时间等常规参数。因为受到禁欲时间等因素的影响，常规精液参数常规分析结果表现为较大的波动性。因而，临床诊断往往需要参考多次精液常规分析，给医生和患者带来了负担。更为重要的是，传统的精液参数检查不能全面地反应精液的全部状况。因此，男性不育经常表现为常规精液参数无明显异常，也使得传统的精液参数检查并不能有效诊断男性不育。因而，临床上亟需用于特发性男性不育的新的诊断方法。代谢组学是继基因组学、蛋白组学、转录组学之后一门新兴的组学技术，它是通过高通量考察生物体系在遗传改变和/或环境改变后代谢产物的变化研究生物体系的一门科学。代谢组学研究具有“无偏”、“全局”、“无假设”、“由数据驱动假设”的特点，因而研究的结论往往具有较高的可靠性和创新性。代谢组学可以系统性回顾、分析和探索细胞、组织和器官产生的小分子生物标记物及其变化情况，更加直观地了解功能表型改变的物质基础，其对象涉及脂代谢、糖代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等生物体的代谢网络，是比基因组学、蛋白组学、转录组学更接近“表型”的组学。代谢组学由于其分析的样本可以为尿液这些无创的样本，可大大减少病人采样的创伤。代谢组学在复杂疾病的诊断中表现出极高的应用潜力和价值，具有灵敏度高且稳定的特点。代谢组学通过对机体的整体代谢组分进行分析研究，从中找出特异性生物标志物，可对临床疾病进行及时、准确、高灵敏度和高特异性的诊断。目前代谢组学在疾病的诊断方面主要应用于冠心病、肝脏疾病、糖尿病、高血压、肥胖和肿瘤。值得注意的是，尿液是临床上容易获得的生物样本，具有无创、体积大的优点。特别适合疾病的诊断和筛查。然而，采用代谢组学分析尿液代谢小分子在特发性男性不育的诊断监测中的应用还未得到相应的关注。目前常见的代谢组学检测平台主要包括核磁共振(NMR)、气相色谱串联质谱(GC-MS)、液相色谱串联质谱(LC-MS)和毛细管电泳串联质谱(CE-MS)。核磁共振虽然是化学物定性的金标准，但存在灵敏度低的缺点，难以获得较为完整的代谢谱。串联质谱具有灵敏度高和定性准确的优势。但是，气相色谱串联质谱只限于检测易挥发的物质，检测范围不能覆盖代谢谱的要求。为了弥补该缺陷，气相色谱串联质谱往往采用衍生化的方法检测化学物，这使得前处理方法变得复杂，引入更多的误差。同时，气相色谱串联质谱检测由于分离技术的限制，一般检测时间较长，延长了实验周期，增加了仪器占用率，限制了其在大样本人群检测中的应用。毛细管电泳串联质谱，对极性化合物的分离检测具有优势，但仪器稳定性的问题较难解决。而液相色谱串联质谱具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点，可以很好地解决上述问题。UPLC-QexactiveMS是新一代高分辨质谱与超高效液相的组合，具有相比传统LC-MS更强的灵敏度、特异度和稳定性。故而采用UPLC-QexactiveMS进行尿液代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与特发性男性不育发病相关的特异尿液代谢小分子作为生物标志物，并研发相应的代谢小分子标志的UPLC-QexactiveMS检测方法，不仅在该领域处于国际领先地位，还可创造令人瞩目的经济效益，对提高我国男性生殖健康水平也将是一次强有力的推动。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物。本专利技术另一个目的是提供上述尿液雌激素代谢物标志物的检测方法。本专利技术再有一个目的是提供检测上述尿液雌激素代谢物标志物的试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的：与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物，该标志物为尿液雌激素代谢物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮。所述的尿液雌激素代谢物标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂盒中的应用。一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，该试剂盒含有检测尿液雌激素代谢物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的试剂。所述的试剂盒，该试剂盒含有采用UPLC-QexactiveMS方法检测尿液雌激素代谢物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的试剂。所述的试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：2-甲氧雌二醇标准品；雄烯二酮标准品；内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸一种或多种物质的同位素内标(氘标，水溶液)；内标B：十五烷酸的同位素内标(氘标，甲醇溶液)；内标C：二十四烷酸的同位素内标(氘标，甲醇溶液)；进一步，该试剂盒还含有：HypersilGOLDC18色谱柱；试剂A：100％甲醇(沉淀蛋白用)；试剂B：含0.1％的甲酸的水(流动相用)；试剂C：含0.1％的甲酸的乙腈(流动相用)；试剂D：100％超纯水(复溶用)。一种检测上述的与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物的方法，其特征在于该方法采用UPLC-QexactiveMS方法，检测尿液雌激素代谢物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的含量。该方法中：一、液相条件：液相色谱柱为HypersilGOLDC18色谱柱(100mm×2.1mm，粒径1.9μmThermoScientific,Germany)，柱温为40℃。流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈，流速为400μL/min；仪器梯度为：0-3min1％B，3-10min1％到99％B，10-13min99％B，13-13.1min99％到1％B，13.1-17min1％B；(B指流动相B，各梯度中流动相A的量与对应的流动相B的量共100％，下同)进样方式：体积5μl；二、质谱条件采用加热电喷雾电离方式(HESI)，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。本专利技术详细描述如下：本专利技术人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的尿液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC-QexactiveMS的代谢组学方法进行分析。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据第一阶段：筛选阶段随机纳入明确诊断的特发性男性不育本文档来自技高网...

【技术保护点】
与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物，其特征在于该标志物为尿液雌激素代谢物2‑甲氧雌二醇和/或雄烯二酮。

【技术特征摘要】
1.与特发性男性不育相关的尿液雌激素代谢物标志物，其特征在于该标志物为尿液雌激素代谢物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮。2.权利要求1所述的尿液雌激素代谢物标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂盒中的应用。3.一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有检测尿液雌激素代谢物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有采用UPLC-QexactiveMS方法检测尿液雌激素代谢物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有下列试剂：2-甲氧雌二醇标准品；雄烯二酮标准品；内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸一种或多种物质的同位素内标；内标B：十五烷酸的同位素内标；内标C：二十四烷酸的同位素内标；6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有：HypersilGOLDC18色谱柱；试剂A：100％甲醇；试剂B：含0.1％的甲酸的水；试剂C：含0.1％的甲酸的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏健，胡艳辉，陈婷，王笑笑，肖甜，周作民，陈道帧，夏彦恺，陆春城，吴炜，韩秀梅，吴笛，杜桂珍，王玉邦，环飞，王心如，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32