过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，采用过氧化氢体外诱导处理猪脾细胞，过氧化氢浓度为50‑450μM。与现有技术相比，本发明专利技术首次使用猪脾细胞作为过氧化氢诱导氧化应激模型的造模细胞，通过考察细胞死亡率和细胞内ROS水平确定了H2O2溶液的最佳使用浓度和细胞孵育时间，操作容易、成本较低，可帮助初次进行猪脾细胞制备和氧化应激模型的研究人员比较顺利的完成猪脾细胞的制备和氧化应激模型的建立。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞氧化应激模型
，尤其涉及一种过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法。
技术介绍
超氧阴离子自由基是活性氧自由基中形成最早的，是氧在进行单电子还原反应中首先形成的产物。超氧阴离子经酶催化后又可以形成羟自由基、脂质过氧化物、过氧化氢和单线态氧等其他活性氧自由基，它的大量生成是机体产生氧化应激的重要原因。羟自由基是目前所知活性氧中对机体毒性最强、危害最大的一种自由基，他可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式参与机体的各类反应，与多种大分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化损伤，死细胞坏死或突变。抗超氧阴离子活力和抑制羟自由基能力可以反映细胞在清除超氧阴离子和抑制羟自由基生成，保护细胞不受氧化应激损伤的能力，是反映细胞抗氧能力的重要指标。过氧化氢容易获得，且性质相对稳定，作为一种重要的活性氧，过氧化氢能够自由通过细胞膜结构，进入细胞后与细胞内的铁离子通过Fenton反应形具有极强细胞毒性的·OH，引起细胞氧化应激，因此被广泛应用于诱导氧化应激的试验中。如：在过氧化氢诱导的A549细胞氧化应激模型中，过氧化氢能够通过降低还原型谷胱甘肽水平诱导组蛋白乙酰化，并激活AP-1和NF-kB通路，促进IL-8的释放，是氧化应激促炎的一种机制；过氧化氢处理BEAS-2B细胞通过降低HDAC2活性，上调组蛋白H4乙酰化水平促进炎症发生。
技术实现思路
：本专利技术要解决的技术问题是提供一种过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，为后续深入研究过氧化氢诱导后能否引起猪脾细胞氧化还原状态的改变及其作用机制提供较理想的体外模型。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，采用过氧化氢体外诱导处理猪脾细胞，过氧化氢浓度为50-450μM。上述过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，分别设细胞对照组和过氧化氢组，用含5％FBS的DMEM或含5％FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；实验组每孔加入经不含血清的细胞培养液稀释的过氧化氢，空白对照组加入等量不含血清的细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，于第4h、8h、12h和24h时，分别收集细胞，采用MTT法检测细胞存活率和荧光法测定细胞内ROS水平。用于MTT法检测细胞存活率的细胞浓度为4×105个/mL，过氧化氢浓度为50-450μM，细胞孵育时间为4h。用于荧光法测定细胞内ROS水平的细胞浓度为5×106个/mL，过氧化氢浓度为100-300μM，细胞孵育时间为30min。猪脾细胞按以下操作制备：无菌取仔猪脾脏，除去表面血渍及纤维组织，用灭菌的注射器内芯在PBS(pH7.2)缓冲液中研磨组织，200目尼龙滤网过滤，收获的脾细胞滤液经过1500rpm，5min离心后，去除上清液；接着加入10mL的Tris-NH4C1溶液，悬浮沉淀细胞，37℃培养箱内放置10min，使红细胞充分裂解，1500rpm，离心5min，弃上清；用PBS液和培养液分别各洗涤一次后用10％FBS的1640完全培养液重悬细胞，200目尼龙滤网再过滤一次，收集细胞滤液；台盼蓝拒染后测定活细胞数，当活细胞数大于95％后计数，备用。专利技术人建立了一种过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，采用过氧化氢体外诱导处理猪脾细胞，过氧化氢浓度为50-450μM。与现有技术相比，本专利技术首次使用猪脾细胞作为过氧化氢诱导氧化应激模型的造模细胞，通过考察细胞死亡率和细胞内ROS水平确定了H2O2溶液的最佳使用浓度和细胞孵育时间，操作容易、成本较低，可帮助初次进行猪脾细胞制备和氧化应激模型的研究人员比较顺利的完成猪脾细胞的制备和氧化应激模型的建立。附图说明图1是H2O2处理对猪脾细胞存活率的影响。图2是H2O2处理对猪脾细胞内ROS水平的影响。具体实施方式一、实验方法1猪脾细胞的制备无菌取仔猪脾脏，除去表面血渍及纤维组织，用灭菌的注射器内芯在PBS(pH7.2)缓冲液中研磨组织，200目尼龙滤网过滤，收获的脾细胞滤液经过1500rpm，5min离心后，去除上清液。接着加入10mL的Tris-NH4Cl溶液，悬浮沉淀细胞，37℃培养箱内放置10min，使红细胞充分裂解，1500rpm，离心5min，弃上清。用PBS液和培养液分别各洗涤一次后用10％FBS的1640完全培养液重悬细胞，200目尼龙滤网再过滤一次，收集细胞滤液。台盼蓝拒染后测定活细胞数，当活细胞数大于95％后计数，备用。2不同浓度过氧化氢处理对细胞存活率的影响(1)实验分组与处理按照SMueller等报道的方法，在紫外分光光度计测OD240值后，按公式：H2O2(mM)＝OD240×1000/39.4计算H2O2浓度。分别设细胞对照组和不同浓度梯度过氧化氢组(50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM)，用含5％FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度为4×105个/mL，并接种于96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；实验组加入每孔加入100μL经不含血清的细胞培养液稀释的不同浓度的过氧化氢，使每组过氧化氢终浓度分别为：猪脾细胞：50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM，空白对照组加入等量不含血清的细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养。(2)MTT法检测细胞存活率继续培养第4h、8h、12h和24h时，弃去部分细胞培养液，每孔保留90μL，加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，37℃，5％CO2培养箱中孵育4h；小心弃去上清液，每孔加入100μLDMSO，摇匀使颗粒溶解后静置10分钟，用酶标仪测定490nm波长处吸光度值，计算细胞存活率。3不同浓度过氧化氢处理对细胞内ROS水平的影响(1)实验分组与处理分别设细胞对照组和不同浓度梯度过氧化氢组(100μM、150μM、200μM、250μM、300μM)，用含5％FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL，接种于24孔板，每孔1000μL，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；实验组加入500μL经不含血清的细胞培养液稀释的不同浓度的过氧化氢，使各组过氧化氢终浓度分别为：猪脾细胞：100μM、150μM、200μM、250μM、300μM，空白对照组加入等量不含血清的细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养。(2)荧光法测定细胞内ROS水平继续培养第4h、8h、12h和24h时收集细胞，PBS洗2次，加入稀释好的DCFH-DA荧光探针(用不含血清的细胞培养液稀释1000倍)200ul，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min；弃去荧光探针，PBS洗3次，加入1000μLPBS缓冲液，收集细胞制成单细胞悬液，每孔取100μL至荧光酶标仪专用的黑色96孔板，用荧光酶标仪测定激发波长488nm，发射波长525nm处荧光值。4实验数据采用SSP18.0统计软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，Duncan组间比较，结果以表示。肩标*表示与对照组相比P＜0.05，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于：采用过氧化氢体外诱导处理猪脾细胞，过氧化氢浓度为50‑450μM。

【技术特征摘要】
1.一种过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于：采用过氧化氢体外诱导处理猪脾细胞，过氧化氢浓度为50-450μM。2.根据权利要求1所述的过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于：所述过氧化氢浓度为50-450μM。3.根据权利要求1所述的过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于：分别设细胞对照组和过氧化氢组，用含5％FBS的DMEM或含5％FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；实验组每孔加入经不含血清的细胞培养液稀释的过氧化氢，空白对照组加入等量不含血清的细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，于第4h、8h、12h和24h时，分别收集细胞，采用MTT法检测细胞存活率和荧光法测定细胞内ROS水平。4.根据权利要求3所述的过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于：所述用于MTT法检测细胞存活率的细胞浓度为4×105个/mL，过氧化氢浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡庭俊，郝祝兵，李春节，韦英益，尹丹，杨剑，谭红连，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45