一种氨基酸神经四肽的合成方法技术

本发明专利技术公开了一种氨基酸神经四肽的合成方法，包括：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂的合成、叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的合成、碱性蛋白酶的预处理、叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂脱保护、叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂合成、叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护、苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护、肽产物分离纯化，本发明专利技术在非水介质中酶法合成了氨基酸神经四肽Phe‑Arg‑Trp‑Gly，四肽合成时选择有机溶剂叔丁醇，并采用在非水有机溶剂中加入三乙胺助溶剂和适当增加水含量，来增加亲水氨基酸的溶解度，解决了亲水氨基酸的利用问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肽合成
，尤其涉及一种氨基酸神经四肽的合成方法。
技术介绍
酶催化肽合成的研究现状：生物活性肽是一类重要的物质，在生命活动中具有各种各样的生物功能，但它们在体内含量极少，提取困难，因此用人工方法合成它们，具有重要的理论意义和实际意义。例如高血压、胃肠病、糖尿病等的起因与治疗均与活性肽相关。目前，在国外，尤其美、日、德等发达国家，医用肽的研究非常活跃。生物技术在肽研制方法的应用已经产生了一批以新方式治疗疾病并确之有效的新药。我国在这一领域的研究有了飞速的发展。合成功能短肽，已有不少报导，有些功能短肽合成已达到工业化的规模。酶法合成的肽类现在主要集中在有实际意义的多肽激素与具有营养的肽类，并且在这些方面，国内外有文献报导，其中较为成功的有利用嗜热菌蛋白酶或木瓜蛋白酶进行天冬糖精的生产，它是一种低热量的新型食品添加剂，对糖尿病人尤其有益。用木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶合成Leu和Met-脑菲肽，用羧肽酶-Y和胰凝乳蛋白酶合成Met-脑菲肽，用嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶等合成雨蛙肽等。陈水田等人用Alcalse在乙醇中合成了含有D型氨基酸的二肽，在理论和实际应用上都有重要的意义。在国外生物活性肽的研究非常活跃，并在肽研制的应用方面产生了一批新药，带来巨大经济效益。日本Grnrtch公司研制的松弛肽用来治疗创伤和侏儒症，以及美国Telios制药公司生产的一种治疗创伤的小肽。创伤愈合肽类在美国年销售额达十亿美元。应用肽类药物攻克艾滋病HIV-1已成为新的尝试，生物活性肽的合成也是一个很活跃的领域，继化学法合成了胰岛素之后，有用酶促半合成法制备了胰岛素类似物。此外，在脑菲肽、心房肽及其类似物的合成，以及人参多肽的研制方面取得了较好的结果。目前肽合成主要有3种方法：化学法、重组DNA技术、酶法。总体上来说，化学法在工业上仍然使用得最多；重组DNA技术由于需要一个长期、昂贵的研究和发展阶段，而且在发酵阶段存在表达效率低和产品提取回收困难等问题，其应用受到很大限制；酶法虽然起步较晚，但近20年来，不少科学家已作了相当多的工作，而且因其与化学法相比，具有副反应少、反应条件温和、区域选择性高和侧链需要较少保护或不需要保护等优势，发展相当迅速。每种方法都有其优点和缺点，单采用一种方法总有难以克服的缺点。在合成的时候具体采用哪种方法合成主要看目标产物所要求的长度和纯度。完全的酶促肽合成主要用于小的肽段(<10)的合成或肽片段的缩合，DNA重组技术更适合用于含有数百个氨基酸的大肽的合成，而对于技术上已经成熟的化学法合成，虽然固相法可以用来合成含有近100个氨基酸的肽，但是其最有实用意义的应用还是用来合成中等长度(10-100)的肽段。现在实验室规模上合成肽主要用的就是化学法，尽管它有固相液相两种不同的方法，但是这两种方法在化学过程上是非常相似的。促肾上腺皮质激素(andrenocorticotropichormone)即ACTH或Corticotropin是一个含三十九个氨基酸的直连多肽，分子量约为4700，羊、猪、牛的ACTH已经提纯，它们除第25-33个氨基酸外，其余部分都相同，ACTH的一级结构如下：HN-丝-酪-丝-蛋-谷-组-苯丙-精-色-甘-赖-脯-缬-甘-赖-赖-精-精-脯-缬-赖-缬-酪-脯-天冬-甘-谷-丙-谷-天冬-丝-丙-谷胺-丙-苯丙-脯-亮-谷-苯丙-COOH，期中序列1-24氨基酸残基具有生物活性，4-10是生物活性中心，既是信息部位，又对受体的结合提供要素，第八位Arg第9位Trp为启动受体的活性中心之一，当Trp的吲哚环修饰后(甲基化或NPS化)或被Phe取代，仍能与肾上腺皮质细胞的脂膜结合，但不能激发c-AMP酶或皮质激素的释放。第9位Trp、第6位His、第5位Glu对皮质酮的生成起关键作用。25-33具有种属特异性及免疫特异性。促肾上腺皮质激素由垂体前叶分泌并受下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的控制。反过来，ACTH的靶器官所分泌的皮质甾体激素对垂体和下丘脑也有反馈作用。ACTH首先在垂体中发现，之后在下丘脑，脑区都有ACHT免疫反应性的活性肽存在，甚至在胃肠中也有ACTH的存在。脑、下丘脑、垂体分泌的ACTH执行不同的功能，大脑中的ACTH可能参与意识行为的调控机理，脑神经元分泌的ACTH类活性肽，可以看作为神经递质的效应物，影响对效应细胞的作用，他们传递信号的距离上短得多，所放电流弱得多。垂体分泌的ACTH主要作用于肾上腺皮质，它能促进肾上腺皮质分泌激素，并促进体内贮存的胆固醇在肾上腺皮质中转化成肾上腺皮质酮。在应激过程中，如灼烧或损伤时，ACTH的分泌量均显著增加，这表明是全身总动员，调动神经与内分泌两个方面的积极活动，ACTH在脑与垂体中的分泌量均与应激程度呈平行关系，这也说明，ACTH族活性肽对神经活动与内分泌作用均有联系。目前临床上使用的促肾上腺皮质激素(ACTH)，是从猪的垂体前叶提取的39肽的，或者是化学合成的类似物18肽、24肽、28肽等。在医学实践上应用ACTH来诊断肾上腺皮质的生理状况，由于化学合成ACTH的成功，在临床上作为柯兴氏综合症的诊断及治疗风湿性关节炎、皮肤炎、眼炎及抗过敏症，也用它来治疗痛风、气喘及皮肤痛等疾患。有研究报导其活性部位七肽(Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly)与人的行为有关，可以使精神健全者的观察力改善，可使人的注意力集中，可以改善人的情绪，使智障的理解力提高，还能使老年人的记忆力增强，它还能减轻焦虑的情绪。在非水介质中酶法合成氨基酸神经四肽Phe-Arg-Trp-Gly(FRWG)，从方法学来看，寡肽的酶法合成，较化学法具有明显的优越性，而且是向非水酶催化合成肽键技术难点冲击，即亲水性氨基酸的利用。手性药物的合成是当前药物合成研究的难点和热点，也是酶促合成优于化学合成具体体现。实际上，目标产物是具有重要应用价值的手性药物，并使在有机介质中合成肽键的方法更普遍化和有效化。在非水介质中酶法合成氨基酸神经四肽Phe-Arg-Trp-Gly(FRWG)是促肾上腺皮质激素(ACTH)活性部位四肽，对神经系统具有明显的调节作用，因而对开发新的肽类药物，具有非常好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种反应条件温和、立体专一性强、不用侧链保护基、几无副反应、比通常的化学合成法环保、不产生手性分子、不用进一步拆分、收率高、并在非水介质中酶法合成氨基酸神经四肽Phe-Arg-Trp-Gly的方法。本专利技术是这样实现的，一种氨基酸神经四肽的合成方法，该氨基酸神经四肽的合成方法包括以下步骤：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂(BOC-Phe-Arg-OMe)的合成：叔丁氧羰基苯丙氨酸(BOC-Phe)加入质量为0.53g(2mmol)，精氨酸甲脂(Arg-OMe)加入质量为1.04g(4mmol)，有机溶剂二甲基甲酰胺(DMF)20ml，1ml三乙胺，一定量的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HClbuffer)，加入胰凝乳蛋白酶(Chymotyrpsin)2g，40℃水浴振荡3天，每隔8h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氨基酸神经四肽的合成方法，其特征在于，该氨基酸神经四肽的合成方法包括以下步骤：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂的合成：叔丁氧羰基苯丙氨酸加入质量为0.53g，精氨酸甲脂加入质量为1.04g，有机溶剂二甲基甲酰胺20ml，1ml三乙胺，三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液，加入胰凝乳蛋白酶2g，40℃水浴振荡3天，每隔8h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的合成：BOC‑Trp加入质量为0.16g，Gly‑OEt加入质量为0.62g，有机溶剂二甲基甲酰胺20ml，1ml三乙胺，三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液，加入胰凝乳蛋白酶2g，40℃水浴振荡3天，每隔8h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；碱性蛋白酶的预处理：取2ml碱性蛋白酶和15ml无水乙醇置于离心管中，旋涡振荡5分钟使其充分混合，混合物3000rpm离心10分钟，碱性蛋白酶与溶剂无水乙醇完全分开，倾去上层的乙醇，此步操作重复三次；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的处理：将含有叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的有机溶剂二甲基甲酰胺，分别减压蒸馏除去有机溶剂二甲基甲酰胺，再用乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯分别用冷柠檬酸洗三次，冷的碳酸氢钠洗两次，再用冷水洗两次，减压蒸馏，除乙酸乙酯，得微黄色无定型物；叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂产物用TFA苯甲醚＝9:1刚好溶解，0℃振荡2‑4小时后加入乙醚：石油醚＝1:3，得沉淀，离心，再加入由乙醚与石油醚按照1:3比例混合构成的混合液洗沉淀，得色氨酸甘氨酸乙脂；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂合成：取2mmol的叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和4mmol的色氨酸甘氨酸乙脂加入锥形瓶，加入有机溶剂叔丁醇20ml，碱性蛋白酶2ml，1ml三乙胺，Na2CO3‑NaHCO3缓冲液，37℃水浴振荡24小时，每隔4h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂产物用TFA:苯甲醚＝9:1刚好溶解，0℃振荡2‑4小时后加入乙醚：石油醚＝1:3，得沉淀，离心，再加入由乙醚与石油醚按照1:3比例混合构成的混合液洗沉淀，得苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂；苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：取4.4g苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂，加入24ml甲醇，2mol/L的NaOH12.5ml，反应一小时，用1mol/L的HCl调节pH至7，抽去甲醇，加水稀释，过滤，冰浴冷却，水洗到中性，得氨基酸神经四肽，用质谱检测产物；肽产物分离纯化：柱料采用Sephadex G－10，层析柱为16mm×1000mm，洗脱液采用蒸馏水，检测波长为220nm，流速为1.0ml/min，取100g SephadexG‑10干柱料，加500ml蒸馏水浸泡过夜，减压除气泡后装柱，洗脱液平衡过夜，待分离液体0.5ml上样层析，收集产品峰，冻干得产物。...

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸神经四肽的合成方法，其特征在于，该氨基酸神经四肽的合成方法包括以下步骤：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂的合成：叔丁氧羰基苯丙氨酸加入质量为0.53g，精氨酸甲脂加入质量为1.04g，有机溶剂二甲基甲酰胺20ml，1ml三乙胺，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，加入胰凝乳蛋白酶2g，40℃水浴振荡3天，每隔8h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的合成：BOC-Trp加入质量为0.16g，Gly-OEt加入质量为0.62g，有机溶剂二甲基甲酰胺20ml，1ml三乙胺，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，加入胰凝乳蛋白酶2g，40℃水浴振荡3天，每隔8h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；碱性蛋白酶的预处理：取2ml碱性蛋白酶和15ml无水乙醇置于离心管中，旋涡振荡5分钟使其充分混合，混合物3000rpm离心10分钟，碱性蛋白酶与溶剂无水乙醇完全分开，倾去上层的乙醇，此步操作重复三次；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的处理：将含有叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的有机溶剂二甲基甲酰胺，分别减压蒸馏除去有机溶剂二甲基甲酰胺，再用乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯分别用冷柠檬酸洗三次，冷的碳酸氢钠洗两次，再用冷水洗两次，减压蒸馏，除乙酸乙酯，得微黄色无定型物；叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂产物用TFA苯甲醚＝9:1刚好溶解，0℃振荡2-4小时后加入乙醚：石油醚＝1:3，得沉淀，离心，再加入由乙醚与石油醚按照1:3比例混合构成的混合液洗沉淀，得色氨酸甘氨酸乙脂；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂合成：取2mmol的叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和4mmol的色氨酸甘氨酸乙脂加入锥形瓶，加入有机溶剂叔丁醇20ml，碱性蛋白酶2ml，1ml三乙胺，Na2CO3-NaHCO3缓冲液，37℃水浴振荡24小时，每隔4h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂产物用TFA:苯甲醚＝9:1刚好溶解，0℃振荡2-4小时后加入乙醚：石油醚＝1:3，得沉淀，离心，再加入由乙醚与石油醚按照1:3比例混合构成的混合液洗沉淀，得苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂；苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：取4.4g苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂，加入24ml甲醇，2mol/L的NaOH12.5ml，反应一小时，用1mol/L的HCl调节pH至7，抽去甲醇，加水稀释，过滤，冰浴冷却，水洗到中性，得氨基酸神经四肽，用质谱检测产物；肽产物分离纯化：柱料采用SephadexG－10，层析柱为16mm×1000mm，洗脱液采用蒸馏水，检...

【专利技术属性】
技术研发人员：李世军，
申请(专利权)人：李世军，
类型：发明
国别省市：吉林;22