烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，属于烟草生物控制领域，能够利用烟草NtNAC096基因对烟草的衰老进行显著调控。该利用烟草NtNAC096基因的基因组DNA序列全长1203bp,由3个外显子和2个内含子组成。上述应用具体包括如下步骤：(1)烟草NtNAC096基因克隆，序列分析；(2)对NtNAC096基因进行表达分析；(3)通过构建烟草NtNAC096基因过表达载体，进行烟草NtNAC096基因功能分析；(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtNAC096基因靶位点进行设计，构建NtNAC096基因敲除载体；对烟草品种进行遗传转化，获得延缓衰老的烟草植株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及烟草衰老控制领域，尤其涉及一种烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用。
技术介绍
叶片衰老是叶片发育的最后一个阶段。在叶片衰老过程中，叶绿素和生物大分子物质如蛋白质、脂类、核酸等被降解，叶片光合能力降低，衰老组织中的营养物质降解转化后被运输到幼嫩组织和生殖器官中供进一步生长发育或储存。因此，叶片的衰老影响作物生长、营养积累和产量的形成。烟草是一种叶用经济作物，叶面积大小和衰老成熟度直接影响到生产产量和质量。目前，对植物衰老的控制主要集中在对植物激素的调节方面，生长素、细胞分裂素等可抑制叶片衰老，乙烯、脱落酸可促进叶片衰老；人为减缓叶片衰老进程，一方面可以通过减少衰老促进激素的合成或代谢，另一方面也可增加衰老抑制激素的合成或代谢。但是激素调节外源作用往往存在效果上的缺陷。鉴于此，利用基因控制衰老的方法开始研究，目前只有少数的烟草衰老基因被鉴定，仍有大量的植物衰老相关的基因有待研究和利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，能够通过NtNAC096基因控制烟草的衰老，通过基因编辑延缓烟草的衰老，从而高效控制烟草的衰老进程。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是:烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，烟草NtNAC096基因的基因组DNA序列全长1203bp，其核苷酸序列如下：其中，序列中双下划线标示的atg为起始密码子，双下划线标示的tga为终止密码子，单下划线标示的部分为内含子,烟草NtNAC096基因由3个外显子和2个内含子组成。进一步的，烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用,包括对烟草NtNAC096基因进行基因功能分析,敲除NtNAC096基因，获得延缓衰老的烟草植株。进一步的，烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，包括如下步骤：(1)烟草NtNAC096基因克隆，序列分析；(2)对NtNAC096基因进行表达分析；(3)通过构建烟草NtNAC096基因过表达载体，进行烟草NtNAC096基因功能分析；(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtNAC096基因靶位点进行设计，构建NtNAC096基因敲除载体；对烟草品种进行遗传转化，获得延缓衰老的烟草植株。进一步的，步骤(2)对NtNAC096基因进行表达分析是用qRT-PCR方法检测NtNAC096基因在烟草不同组织和不同叶片生育时期的表达模式。进一步的，步骤(3)构建烟草NtNAC096基因过表达载体的方法为利用clontechinfusion同源重组方法将NtNAC096构建进入过表达载体pRI101-AN，构建烟草NtNAC096基因过表达载体pRI101-NtNAC096。进一步的，步骤(3)构建烟草NtNAC096基因过表达载体后，利用农杆菌介导的浸花法侵染拟南芥得到转基因拟南芥，进行烟草NtNAC096基因功能分析。进一步的，步骤(4)对烟草NtNAC096基因设计两个靶位点，人工合成加接头序列，靶位点连接到载体pORE-Cas9上，获得pORE-Cas9/NtNAC096载体。进一步的，步骤(4)对烟草品种进行遗传转化的具体操作为：pORE-Cas9/NtNAC096载体转化农杆菌感受态LBA4404，利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法对烟草进行遗传转化，获得延缓衰老的烟草植株。相对于现有的烟草衰老控制，本专利技术的有益效果在于:1、首次发现烟草NtNAC096基因用于控制烟草衰老；2、利用基因编辑技术能够精确快速的利用烟草NtNAC096基因控制烟草衰老进程，通过突变该基因核苷酸序列筛选得到延缓衰老的烟草植株，在农业生产上具有十分重要的应用，对烟叶的采摘、品质控制、筛选烟草品种和提高产量都有十分显著的影响。附图说明图1为本专利技术一实施例的烟草NtNAC096基因DNA序列扩增结果电泳图；图2为本专利技术一实施例的烟草NtNAC096基因cDNA序列扩增结果电泳图；图3为本专利技术一实施例的烟草NtNAC096基因组织表达分析；图4为本专利技术一实施例的烟草NtNAC096基因烟草叶片不同发育时期表达分析；图5为植物过表达载体pRI101-NtNAC096构建和验证电泳图；图6为pRI101-NtNAC096转基因拟南芥植株鉴定和表型图；图7为烟草CRISPR/Cas9转基因阳性植株NtNAC096基因包含靶位点序列目的片段电泳图；图8为转基因烟株内源NtNAC096基因靶序列分析结果图；图9为烟草NtNAC096敲除突变体表型图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例提供了一种烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，烟草NtNAC096基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，通过分析，烟草NtNAC096基因由3个外显子和2个内含子组成。对烟草NtNAC096基因进行基因功能分析后敲除NtNAC096基因，获得延缓衰老的烟草植株。本专利技术实施例还提供了烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用方法，具体包括如下步骤：S1烟草NtNAC096基因克隆，序列分析。本步骤以烟草基因组DNA和cDNA为模板，设计引物，扩增得到烟草NtNAC096基因的基因组DNA和cDNA，分析基因组DNA的内含子和外显子序列。S2对NtNAC096基因进行表达分析。本步骤通过对烟草NtNAC096基因的表达进行分析可以获得该基因的作用部位和作用时期。S3通过构建烟草NtNAC096基因过表达载体，进行烟草NtNAC096基因功能分析。本步骤中通过过表达载体的构建，利用农杆菌介导制备转基因的拟南芥植株，在拟南芥上对该基因进行功能分析可以对烟草NtNAC096基因进行功能上的验证，为其应用做理论准备。S4利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtNAC096基因靶位点进行设计，构建NtNAC096基因敲除载体；对烟草品种进行遗传转化，获得延缓衰老的烟草。本步骤中运用基因编辑技术可以随机的编辑烟草NtNAC096基因，再通过转基因技术可以调控烟草的衰老，改变烟草的衰老进程，培育晚衰的烟草品种，从整体上控制烟草的衰老。作为本专利技术的优选实施例，步骤S2对NtNAC096基因进行表达分析，可以用qRT-PCR方法检测NtNAC096基因在烟草不同组织和不同叶片生育时期的表达模式。qRT-PCR的方法高效直观，但是可以理解的是，本领域其他的检测基因表达的方法，例如RT-PCR、northern杂交等也可以用于上述NtNAC096基因的表达分析。作为本专利技术的优选实施例，构建烟草NtNAC096基因过表达载体的方法为利用clontechinfusion同源重组方法将NtNAC096构建进入过表达载体pRI101-AN，构建烟草NtNAC096基因过表达载体pRI101-NtNAC096。可以理解的是，过表达载体pRI101-AN是经过筛选的针对烟草NtNAC096基因适宜的载体，其他的基因过表达载体也可以用于上述过表达载体的构建。作为本专利技术的优选实施例，利用农本文档来自技高网...

【技术保护点】
烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，其特征在于，烟草NtNAC096基因的基因组DNA序列全长1203bp，其核苷酸序列如下：其中，序列中双下划线标示的atg为起始密码子，双下划线标示的tga为终止密码子，单下划线标示的部分为内含子,烟草NtNAC096基因由3个外显子和2个内含子组成。

【技术特征摘要】
1.烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，其特征在于，烟草NtNAC096基因的基因组DNA序列全长1203bp，其核苷酸序列如下：其中，序列中双下划线标示的atg为起始密码子，双下划线标示的tga为终止密码子，单下划线标示的部分为内含子,烟草NtNAC096基因由3个外显子和2个内含子组成。2.根据权利要求1所述的烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，其特征在于，上述应用包括对烟草NtNAC096基因进行基因功能分析,敲除NtNAC096基因，获得延缓衰老的烟草植株。3.根据权利要求2所述的烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，其特征在于，上述应用包括如下步骤：(1)烟草NtNAC096基因克隆，序列分析；(2)对NtNAC096基因进行表达分析；(3)通过构建烟草NtNAC096基因过表达载体，进行烟草NtNAC096基因功能分析；(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtNAC096基因靶位点进行设计，构建NtNAC096基因敲除载体；对烟草品种进行遗传转化，获得延缓衰老的烟草植株。4.根据权利要求3所述的烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用，其特征在于，步骤(2)对NtNAC096基因进行表达分析是用qRT-PCR方法检测NtNAC0...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭永峰，李伟，张增林，王卫锋，高晓明，王晓夏，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37