一种丹皮提取物、提取方法及其在抗肿瘤药物中的应用技术

本发明专利技术涉及一种丹皮提取物、提取方法及其在抗肿瘤药物中的应用，属于天然药物技术领域。丹皮提取物是由丹皮经过水提取之后，再经过大孔树脂进行吸附、洗脱处理而得到。提取方法，包括如下步骤：第1步，取丹皮，加水浸泡，再进行煎煮；第2步，将第1步得到的煎液经过大孔树脂进行吸附、洗脱处理，洗脱液经过减压浓缩、干燥后，得到提取物。丹皮提取物对于Ras基因具有明显的抑制调节作用，采用本发明专利技术提供的提取方法可以获得效果明确的提取物，提取过程方法简单、收率高、纯度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种丹皮提取物、提取方法及其在抗肿瘤药物中的应用，属于天然药物

技术介绍
丹皮为毛茛科植物牡丹干燥根皮。产于安徽、山东等地。秋季采挖根部，除去细根，剥取根皮，晒干。生用或炒用。丹皮入心、肝、肾经。具有清血，活血散瘀的功能。主治斑疹吐血，血滞经闭，经前发势，痈肿疮毒，损伤瘀血，阴虚发势，无汗骨蒸。临床上主要用于清肝火和凉血散瘀（消炎、降压），如因肝郁火而致的发热、盗汗、自汗、头痛目涩、月经不调，常配栀子、柴胡等。秀丽隐杆线虫作为模式生物，通过遗传分析和显微观察，对线虫由受精卵分裂、分化发育为成虫的过程做了全面的跟踪观察，发现线虫调节器官发育和程序性细胞死亡的几个关键因素，在高等动物和人体中也存在[1]。来自希伯来大学和约翰霍普金斯大学医学院的研究人员研究线虫细胞核膜中诱导的突变[2]。加拿大的研究人员利用秀丽隐杆线虫筛选了14100种小分子化合物找到了一个叫Nemadipine-A物质，它能够引起线虫形态和产卵异常[3]，秀丽隐杆线虫还可用于对驱虫药物的筛选[4]。樟脑丸的一种代谢产物1，4萘醌课抑制线虫的促凋亡蛋白CED-3的活性，从而抑制细胞的凋亡[5]。生物分析已经广泛用于各种毒理研究，线虫进行药物毒性的研究最基本方法就是观察统计经过待测物质处理若干时间后线虫的存活率，将线虫应用于化学试剂毒性检测，如对（甲基硫酸乙酯）进行的毒性研究[6]，还有将线虫用于环境水质的检测，通过线虫的成活率来评定水的毒性大小。Ras是一种小分子蛋白GTPase，是肉瘤病毒基因的同源物。秀丽隐杆线虫中的let-60编码的Ras是调节线虫阴门发育的一个因子[7]。随后，KayneandSternberg等[8]人利用遗传学工具阐明了LET-60Ras信号通路，该通路主要是调节线虫阴门发育和雄性交合刺的形成。Ras信号通路是高度保守的，线虫中的Ras蛋白与人类的K-Ras和N-Ras蛋白在最前面的164个氨基酸(总共184个氨基酸)中有83%是完全相同的，且其信号通路上的大部分因子都能在哺乳动物上找到同源物。
技术实现思路
近年来，中药由于其毒副作用小越来越引起更多人的关注，本专利技术利用秀丽隐杆线虫作为模型生物筛选下调ras过渡激活的抗肿瘤中药及药物急性毒性研究。本专利技术发现采用秀丽隐杆线虫突变体筛选具有下调ras过渡激活的抗肿瘤活性中药，丹皮的提取物显示出抗肿瘤活性好且毒性较小的优点。技术方案是：一种丹皮提取物，它是由丹皮经过水提取之后，再经过大孔树脂进行吸附、洗脱处理而得到。丹皮提取物的提取方法，包括如下步骤：第1步，取丹皮，加水浸泡，再进行煎煮；第2步，将第1步得到的煎液经过大孔树脂进行吸附、洗脱处理，洗脱液经过减压浓缩、干燥后，得到提取物。所述的第1步中，加水浸泡步骤中加水重量是丹皮的5倍；煎煮次数是3次。所述的第1步中，大孔树脂是HPD400大孔吸附树脂，洗脱处理采用的是85v/v%的乙醇进行洗脱，洗脱液为提取物溶液。丹皮提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物，是指抑制原癌基因ras通路过度激活的抗肿瘤药物。有益效果本专利技术提供了一种丹皮提取物，它对于Ras基因具有明显的抑制调节作用，采用本专利技术提供的提取方法可以获得效果明确的提取物，经过大孔吸附树脂处理了煎液之后，可以显著降低提取物的毒性以及提高对Ras基因的抑制效果，提取过程方法简单、收率高、纯度高。附图说明图1是成虫野生型在倒置显微镜下的形貌图；图2是有一个假阴门的突变体线虫在倒置显微镜下的形貌图；图3是有两个假阴门的突变体线虫在倒置显微镜下的形貌图；图4是有三个假阴门的突变体线虫在倒置显微镜下的形貌图；图5是丹皮提取物对线虫突变体MT2124的作用(**p<0.01)；图6是实施例1提取物的急性毒性曲线；图7是对照例1提取物的急性毒性曲线。具体实施方式实验部分1、仪器、试剂及实验材料1.1仪器：CJ-26型洁净工作台，DXC型紫外线消毒车，TGL-13型电动离心机，XH-B型旋涡混匀器，HZQ-F160A型恒温振荡器，GFL303型气浴恒温摇床，海尔BCD20JV型电冰箱，ASV-3023型全自动高压消毒柜，Biofugestratos型高速冷冻离心机，浮游生物计数板，计时器，移液枪，枪头，离心管，微孔滤膜，温度计，注射器，烧杯，锥形瓶，枪盒，酒精灯，镊子，接种环，涂菌棒，培养皿，96孔板。1.2实验材料秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）：秀丽隐杆线虫MT2124，let-60ras(gf)突变体，购于美国线虫遗传中心。大肠杆菌：大肠杆菌OP50，线虫的食物，购于美国线虫遗传中心。丹皮药材，购于兰州惠仁堂药业。1.3溶液的配置NGM培养基：100ml纯净水加入0.3031g氯化钠，1.7033g磷酸二氢钾，0.2309g磷酸氢二钾，0.27185g蛋白胨，1.7155g琼脂，使其全部溶解。（灭菌后加0.2ml氯化钙，0.2ml硫酸镁，0.1ml胆固醇。）Sbasal：100ml纯净水加0.585g氯化钠,0.1g磷酸氢二钾，0.6g磷酸二氢钾，混合均匀灭菌。S基础液：100mlSbasal加入1ml柠檬酸，1mlTrace,100μl胆固醇，300μl硫酸镁，300μl氯化钙，混合均匀。（现配现用）LB培养基：100ml纯净水加入1.0g蛋白胨，0.5g酵母粉，1.0g氯化钠，混合均匀灭菌（再加1.7155g琼脂，灭菌，得LB固体培养基）。M9缓冲液：100ml纯净水加0.49725g氯化钠，0.5964g磷酸氢二钠，0.2992g磷酸二氢钾，0.012g硫酸镁，混合均匀，灭菌。裂解液：1M氢氧化钠：2.4%次氯酸钠按1：1的比例混合。实施例1丹皮提取物制备称取50g丹皮药材，加十倍量纯净水，浸泡半小时，煎煮三次，每次1h，合并滤液，浓缩至50ml，制成1g/ml(按生药材计)的药液，离心（10000rpm20min），0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，再将滤液送入填充有HPD400大孔吸附树脂进行吸附，滤液进料量是5BV，再采用85v/v%的乙醇进行洗脱，洗脱液用量是3BV，洗脱液经过减压浓缩、干燥后，得到丹皮提取物。对照例1丹皮提取物制备与实施例1的区别在于：未采用大孔吸附树脂进行吸附和洗脱处理。称取50g丹皮药材，加五倍量纯净水，浸泡半小时，煎煮三次，每次1h，合并滤液，浓缩至50ml，制成1g/ml(按生药材计)的药液，离心（10000rpm,20min），微孔滤膜过滤，收集滤液，再将滤液经过减压浓缩、干燥后，得到丹皮提取物。实施例2药效试验大肠杆菌OP50培养将从线虫遗传中心购置的在固体培养基上培养的OP50，用接种环接种到LB液体培养基中，放在摇床上,培养条件200rpm，20℃，培养24h，一部分用于涂菌，每板加400μl菌液，用涂菌棒涂布均匀，放置恒温培养箱中培养24h，用于线虫转板；另一部分离心（10000rp10min）得到固体菌，将其称重，然后稀释成110mg/ml的菌液，置于4℃冰箱保存。线虫培养将冻存于-80℃冰箱中的秀丽隐杆线虫MT2124转接到涂有OP50的固体NGM培养基上，在20℃下培养成虫进行同步化。将同步化线虫孵化成L1期小线虫用于药物活性实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丹皮提取物，其特征在于，它是由丹皮经过水提取之后，再经过大孔树脂进行吸附、洗脱处理而得到。

【技术特征摘要】
1.一种丹皮提取物，其特征在于，它是由丹皮经过水提取之后，再经过大孔树脂进行吸附、洗脱处理而得到。2.权利要求1所述的丹皮提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：第1步，取丹皮，加水浸泡，再进行煎煮；第2步，将第1步得到的煎液经过大孔树脂进行吸附、洗脱处理，洗脱液经过减压浓缩、干燥后，得到提取物。3.根据权利要求2所述的丹皮提取物的提取方法，其特征在于，所述的第1步中，加水浸泡...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘东玲，周婷，王瑞琼，李秋林，姚娟，袁菊丽，刘雪枫，
申请(专利权)人：甘肃中医药大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62