本发明专利技术属于生物医学技术领域，涉及一种乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的疫苗及其制备方法，本发明专利技术还涉及所述疫苗预防乙肝病毒感染和治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)感染的用途，以及所述疫苗联合HBsAg疫苗治疗慢性乙型肝炎的用途。本发明专利技术的疫苗包含乙肝病毒包膜蛋白preS1区域。本发明专利技术的疫苗能够有效预防HBV感染宿主，同时本发明专利技术的疫苗对于慢性乙型肝炎病毒感染具有治疗性效果，其效果显著优于现有的传统HBV疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，涉及一种乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)的疫苗及其制备方法，本专利技术还涉及所述疫苗预防乙肝病毒感染和治疗慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)感染的用途，以及所述疫苗联合HBsAg疫苗治疗慢性乙型肝炎的用途。
技术介绍
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)为双链DNA病毒，属于嗜肝性病毒，能够通过血液和体液接触进行传播。在感染肝脏后，HBV能够引发多种疾病，包括急性和慢性肝炎，肝纤维化，肝硬化和肝癌。全球范围内大约有2.4亿慢性乙型肝炎患者，每年有大约100万人死于HBV感染所导致的肝硬化和肝癌(1)。但是目前仍旧没有有效治疗慢性乙型肝炎的策略，现有的HBV治疗方式主要包括抗病毒药物(核苷类似物)和干扰素，它们虽然有一定的治疗效果疗效，但是通常不能诱导有效的免疫应答，从而无法彻底清除HBV感染；而且长期用药导致的副作用较大，抗病毒药物也会产生耐药性。慢性HBV感染是威胁人类身体健康的主要疾病之一，探索慢性乙型肝炎有效的免疫治疗策略迫在眉睫，研制慢性乙型肝炎的治疗性疫苗具有十分重要的社会意义和经济意义。HBV疫苗研究主要分为三个发展阶段：第一代疫苗以患者血液提取乙肝病毒抗原HBsAg为疫苗；第二代疫苗由基因工程构建酵母表达重组HBsAg疫苗；第三代乙肝疫苗则由真核细胞表达乙肝病毒全长包膜蛋白基因，为含有L-HBsAg，M-HBsAg以及HBsAg的混合疫苗。乙肝病毒有三种包膜蛋白，分别是smallHBsAg(S-HBsAg)，简称为HBsAg，middleHBsAg(M-HBsAg)和largeHBsAg(L-HBsAg)。S-HBsAg由226个氨基酸组成，是目前临床预防性乙肝疫苗的成分，也是慢性乙型肝炎患者血清中假病毒颗粒(pseudovirus)的主要成分；M-HBsAg是在HBsAg的N端连接有一个55个氨基酸的preS2区域，也是假病毒颗粒的重要组成成分；L-HBsAg是在M-HBsAg的N端连接有一个由108个或119个氨基酸(根据乙肝不同亚型，ay型108个，ad型119个)组成的preS1区域。目前preS1疫苗的研究，多集中在融合蛋白疫苗，如含有L-HBsAg的第三代HBV预防性疫苗(2)，以及将preS1表位融合表达在HBV病毒核衣壳蛋白表面等等，以期提高其免疫原性(3)。研究表明第三代疫苗能够提高HBsAg的抗体应答率，在一些对传统疫苗没有应答的接种者体内，也能够诱导很好的抗体反应(4,5)。但是由于缺乏合适的动物模型，目前尚未明确第三代疫苗对慢性乙型肝炎的临床治疗性效果。另外，preS1N端的豆蔻酰化修饰能够将其插入到内质网膜，从而限制了L-HBsAg的分泌表达，这也成为限制第三代疫苗生产效率的因素(6,7)。再者，这些研究忽略了慢性乙型肝炎感染过程中，HBsAg，HBcAg蛋白的免疫耐受情况，将preS1同免疫耐受的抗原融合表达，很可能在慢性乙型肝炎中诱导preS1的免疫耐受，因而限制preS1疫苗的治疗性效果。HBV诱导的免疫耐受，是治疗慢性乙型肝炎的瓶颈。在HBV感染过程中，HBV病毒粒子能够抑制pDC分泌一型干扰素(8)，血清中大量游离的HBsAg和HBeAg可以抑制TLR受体活化从而影响pDC的功能(9,10)。这些都限制了天然免疫系统对于HBV感染的清除作用。获得性免疫对于HBV清除至关重要(11)。CD8+T细胞能够通过直接杀伤感染的肝脏细胞而控制HBV感染(12)，CD4+Thelper细胞则可以通过分泌IFN-γ，TNF-α等细胞因子，以及辅助特异性CTL应答来清除细胞内的HBV病毒(13)。另外，CD4+Thelper细胞对于特异性病毒抗体的产生具有重要辅助作用。但是在CHB患者中，HBV特异性适应性免疫呈现耐受状态，无法对HBV常规疫苗产生应答，从而导致慢性持续性病毒感染。目前对于CHB免疫耐受机制的阐述仍不明确，有观点认为，CHB感染中持续的高水平的抗原和病毒滴度是导致免疫耐受的重要原因。高滴度病毒和抗原的持续，促使HBV特异性T细胞功能逐渐失活，直至最终凋亡而被清除(14,15)。另外由于肝脏的特殊性，高水平的抗原通常在该器官引起免疫耐受(16)。在临床研究中发现，在CHB感染过程中，HBV特异性T细胞上调多种免疫抑制分子影响其功能，如Bim，CTLA-4，PD-1，TIM-3等等(17-19)；而且CHB患者中存在更多的调节性T细胞(Treg)(20)。这些都限制了获得性免疫清除HBV感染的能力，是导致CHB持续感染的重要原因。但是也有研究表明慢性HBV感染过程中，不同的病毒抗原存在不同的耐受状态。相对于HBeAg抗原诱导的免疫耐受，HBcAg能够在慢性感染者中诱导特异性IgM反应，但是，由于HBeAg和其序列的同源性，大量游离的HBeAg诱导针对HBcAg的特异性T细胞反应耐受(21,22)。同样KazuhiroK.等发现，以HBV蛋白聚合酶(polymerase，HBp)作为疫苗可以在HBV转基因小鼠中诱发免疫应答，只是由于CTL数量以及质量的缺陷，HBp疫苗并没有较好的治疗效果(23)。
技术实现思路
我们认为抗原滴度以及抗原免疫原性在诱导慢性HBV感染免疫反应中，发挥了重要作用。preS1的滴度远远低于HBV其它的包膜蛋白。而且最新的研究已经表明，preS1的N端能够同人肝脏细胞表面NTCP受体结合，从而介导HBV的感染(24)。因而preS1特异性抗体能够中和HBV病毒并且可以保护宿主免受HBV病毒的感染。构建基于preS1蛋白的疫苗能引发相应的抗体应答和T细胞免疫反应。以上特点显示preS1具有作为HBV疫苗的潜力，特别是具有治疗慢性HBV感染的潜力。在一个方面，本专利技术提供了一种乙肝病毒感染治疗策略。在一个方面，本专利技术提供了一种通过原核表达系统，该系统能够用于表达纯化preS1蛋白。在一个方面，本专利技术提供了一种联合佐剂促进preS1免疫反应的策略，通过将preS1抗原和佐剂混合，能够显著增强preS1免疫原性。在一个方面，本专利技术提供了一种采用preS1抗原作为疫苗，直接用于预防HBV感染的策略，其同临床使用的HBsAg疫苗具有相同的保护性效果。在一个方面，本专利技术提供了一种采用preS1抗原作为疫苗，治疗慢性乙型肝炎的策略，直接以preS1作为疫苗能够在慢性乙型肝炎感染宿主体内诱导强将的免疫应答，显著降低HBV相关抗原的表达，并且清除血清中HBV病毒，同时阻断病毒对于肝脏细胞的感染。在一个方面，本专利技术提供了一种采用preS1抗原作为疫苗，联合乙肝包膜蛋白HBsAg蛋白作为慢性乙型肝炎治疗的策略，该策略能够最终诱导慢性乙型肝炎宿主体内HBsAg-HBsAb的血清学转化，同时显著清除肝内的HBV病毒，对于慢性乙型肝炎感染具有一定的治愈效果。具体地，本专利技术涉及以下各项：1.一种用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性疫苗，所述疫苗的活性成分是氨基酸序列与乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1区域的氨基酸序列相同的蛋白质。2.根据1所述的疫苗，其中所述preS1区域的氨基酸序列如SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示。3.根据1所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。4.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性疫苗，所述疫苗的活性成分是氨基酸序列与乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1区域的氨基酸序列相同的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性疫苗，所述疫苗的活性成分是氨基酸序列与乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1区域的氨基酸序列相同的蛋白质。2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述preS1区域的氨基酸序列如SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示。3.根据权利要求1所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。4.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述佐剂包括铝佐剂(Alum)、Toll样受体4激活剂配体MPLA、Toll样受体9配体，寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)和弗氏佐剂。5.氨基酸序列与乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1区域的氨基酸序列相同的蛋白质在制备用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅阳心，边英杰，彭华，孙志辰，刘龙超，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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