具有扩展的底物范围和提高的转录产率的T7 RNA 聚合酶变体制造技术

公开了具有增强的转录活性的T7 RNA聚合酶变体。T7 RNA聚合酶变体是已知为具有将经修饰的核糖核苷酸引入到生长中的RNA分子中的能力。然而，这些变体具有相对低水平的转录活性。本文提供的是提高具有扩展的底物范围的变体转录活性的突变。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请交叉引用本申请要求2014年3月20日提交的美国临时申请第61/968231号的优先权。以上引用的公开的文本整体通过引用特别并入本文而不放弃任何权利。专利技术背景A.专利
本专利技术一般涉及蛋白质工程领域。更具体地，本文公开了具有引入经修饰的核苷酸的能力和提高的转录活性的T7RNA聚合酶变体。B.相关技术说明RNA是广泛通用和有用的，但其化学不稳定性可以使其不适用于许多治疗功能和生物技术功能。具有化学性质的改变、特别是修饰了(脱氧)核糖2'位置的寡核苷酸证明为很有价值(Wilson和Keefe,2006)。2'-O-甲基RNA作为反义探针具有更高的Tm、更快的动力学和更高的稳定性(Majlessi等人,1998)，具有2'F和2'-O-甲基RNA的siRNA也已经证明是更稳定的和具有靶向性的(Layzer,2004；Kraynack和baker,2006；Jackson等人,2006；Dean和Bennet,2003)。此外，具有2'修饰的NTP的体外选择产生了具有更高稳定性和提高的化学势的适配体以及核酶(Healy等人,2004；Waters等人,2011；Lupold等人,2002；Keefe和Cload,2008；Burmeister等人,2005；Beaudry等人,2000)。尽管经修饰的RNA可以是化学合成的，但通常优选为酶促产生(尤其是体外选择)(Ellington和Szostak,1990)。T7RNA聚合酶长期以来用于体外RNA的生成，先前已被工程化并演变为具有扩展的底物范围。最著名地，Y639F突变使得包含具有2'-氟和2'-氨基修饰的核糖的核苷酸的RNA转录物的聚合(Kostyuk等人,1995；Sousa和Padilla,1995；Huang等人,1997)。其他的突变H784A被认为在引入修饰的核苷酸后消除了过早的终止，Y639F、H784A(“FA”)双突变可以引入具有在2'位置大量修饰(例如2'-O-甲基)的核苷酸(Padilla和Sousa,2002；Brieba和Sousa,2004)。先前，定向进化法已被用于生成具有扩展底物特异性的其他的T7RNA聚合酶变体，在所述定向进化法中前述的Y639和H784残基以及重要的R425和G542被随机化(Chelliserrykattil和Ellington,2004)。所得的库被富集用于保留体内转录RNA能力(与天然核糖)的T7RNA聚合酶变体，并被筛选用于体外改变的底物特异性。被称为“RGVG”(R425、G542、Y639V、H784G加上其他的在选择期间有机地产生的E593G和V685A突变)的突变体显示对2'-O-甲基UTP的强活性。被称为“VRS”(G542V和H784S以及其他的H772R突变)的第二突变体能够引入2'-氟修饰的嘧啶。更多近期研究还发现了“2P16”突变体(具有7个其他突变的RGVG版本(Siegmund等人,2012))和R425C突变体(Ibach等人,2013)。这些突变体中的每一个都被报道为能够生成2'-O-甲基RNA。尽管这些酶独特的催化性质使其成为有用工具，然而其中的一些甚至对正常核糖核苷酸仍具有低的活性。已经提出了赋予酶新活性的突变，但也使蛋白质不稳定，总体具有较低的活性和低的转录产率(Wang等人,2002；Romero等人,2009)。专利技术概述本申请提供了针对目前与能够引入修饰的核苷酸的T7RNA聚合酶变体有关的低活性问题的解决方法。在某些方面，公开了具有突变的T7RNA聚合酶变体，其可以提高具有扩展底物范围的突变体的活性。所得聚合酶突变体可以用于生成2'-O-甲基修饰的RNA，收率远高于目前所用的酶。公开了T7RNA聚合酶变体，其包含：一种或更多种底物扩展型氨基酸替换，其赋予了与野生型T7RNA聚合酶相比增强的引入2'-修饰单核苷酸的能力；一种或更多种活性增强型氨基酸替换，其相对于不含活性增强型氨基酸替换的T7聚合酶变体提高T7聚合酶变体的转录活性。在一些实施方案中，一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括与野生型T7RNA聚合酶序列SEQIDNO:1相关的一种或更多种以下氨基酸替换：G542V、E593G、Y639V、Y639F、V685A、H772R、H784A、H784S和H784G。在一些实施方案中，一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括G542V、H772R和H784S。在一些实施方案中，一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括Y639F。在一些实施方案中，一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括Y639F和H784A。在一些实施方案中，一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括E593G、Y639V、V685A和H784G。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶变体能够引入到生成的RNA链中的2'-修饰的单核苷酸包括2'-氟CTP、2'-氟UTP、2'-氟ATP、2'-氟GTP、2'-氨基CTP，2'-氨基UTP、2'-氨基ATP、2'-O-甲基UTP、2'-O-甲基ATP、2'-O-甲基CTP和2'-O-甲基GTP中的一种或更多种。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括以下氨基酸替换中的一种或更多种：P266L、S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括以下氨基酸替换中的两种或更多种：P266L、S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括P266L、S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括P266L。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括S633P和F849I。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括S633P和F880Y。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括F849I和F880Y。在一些实施方案中，一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括S633P、F849I和F880Y。还公开了包含以下氨基酸替换的T7RNA聚合酶变体：N433T、E593G、Y639V、V685A、H784G、S430P、S633P、F849I和F880Y。还公开了编码上述任意T7RNA聚合酶变体的核酸分子。还公开了包含编码上述任意T7RNA聚合酶变体的核酸序列的表达载体。还公开了用这种表达载体转化的分离细胞，其中经转化的细胞能够表达上述任意T7RNA聚合酶变体。还公开了包含任意上述T7RNA聚合酶变体、包含T7RNA聚合酶启动子的DNA模板，和一种或更多种2'-修饰的单核苷酸的反应混合物。在一些实施方案中，一种或多种2'-修饰的单核苷酸包含一种或更多种2'-氟CTP，2'-氟UTP，2'-氟ATP，2'-氟GTP，2'-氨基CTP，2'氨基UTP，2'-氨基ATP，2'-O-甲基UTP，2'-O-甲基的ATP，2'-O-甲基CTP，和2'-O-甲基的GTP。还公开了制备包含一种或更多种2'-修饰的单核苷酸的RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种T7RNA聚合酶变体，其包含：一种或更多种底物扩展型氨基酸替换，其赋予与野生型T7RNA聚合酶相比增强的引入2'‑修饰的单核苷酸的能力；一种或更多种活性增强型氨基酸替换，其相对于不含活性增强型氨基酸替换的T7聚合酶变体提高T7聚合酶变体的转录活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.20 US 61/968,2311.一种T7RNA聚合酶变体，其包含：一种或更多种底物扩展型氨基酸替换，其赋予与野生型T7RNA聚合酶相比增强的引入2'-修饰的单核苷酸的能力；一种或更多种活性增强型氨基酸替换，其相对于不含活性增强型氨基酸替换的T7聚合酶变体提高T7聚合酶变体的转录活性。2.根据权利要求1所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括与野生型T7RNA聚合酶序列SEQIDNO:1相关的一种或更多种以下氨基酸替换：G542V、E593G、Y639V、Y639F、V685A、H772R、H784A、H784S和H784G。3.根据权利要求1或2所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括G542V、H772R和H784S。4.根据权利要求1或2所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括Y639F。5.根据权利要求1或2所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括Y639F和H784A。6.根据权利要求1或2所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种底物扩展型氨基酸替换包括E593G、Y639V、V685A和H784G。7.根据权利要求1所述的T7RNA聚合酶变体，其中2'-修饰的单核苷酸包括2'-氟CTP、2'-氟UTP、2'-氟ATP、2'-氟GTP、2'-氨基CTP、2'-氨基UTP、2'-氨基ATP、2'-O-甲基UTP、2'-O-甲基ATP、2'-O-甲基CTP和2'-O-甲基GTP中的一种或更多种。8.根据权利要求1至7中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括以下氨基酸替换中的一种或更多种：P266L、S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。9.根据权利要求1至8中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括以下氨基酸替换中的两种或更多种：P266L、S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。10.根据权利要求1至8中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。11.根据权利要求1至8中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括P266L、S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y。12.根据权利要求1至8中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括P266L。13.根据权利要求1至8中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括S633P和F849I。14.根据权利要求1至8中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一种或更多种活性增强型氨基酸替换包括S633P和F880Y。15.根据权利要求1至8中任一项所述的T7RNA聚合酶变体，其中所述一...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·D·埃林顿，亚当·J·迈耶，
申请(专利权)人：德克萨斯大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US