本发明专利技术公开了一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201660。本发明专利技术通过生物技术手段制备的抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株7D3F11，为检测PEDV的感染建立了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体地说，涉及一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea,PED）首次报道于英国，随后比利时，德国，加拿大，日本，瑞士等多个国家相继报道，我国于1976年发现此病并陆续报道。猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的，以猪呕吐，严重腹泻脱水为主要临床症状特征的高度接触性传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率可达100%，死亡率高达95%以上。PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为不分节段的单股正链RNA,基因组全长约28033bp，编码的结构蛋白主要有纤突(spike)蛋白(即S蛋白)，囊膜（Membrane）蛋白（即M蛋白），核衣壳（nucleocapsid）蛋白(即N蛋白)。其中S蛋白由1383个氨基酸组成,分子质量为180～220ku,是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白,在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞,在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用。目前,孙东波等通过对克隆的S基因序列进行分析,并与部分冠状病毒S蛋白抗原表位区进行比对,预测到S蛋白的一个抗原表位区(83～276aa),同时通过构建原核表达载体证明预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位。近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋势，危害比较严重，给养猪业带来巨大经济损失，已成为中国甚至世界最常见的猪腹泻传染病之一。由于PED与其他腹泻性传染病尤其是TGE在流行病学，临床症状和病理剖检等变化上难以区分。目前，我国PEDV的诊断主要还是依赖于常规实验室诊断，其操作过程复杂，耗时，并且需要昂贵的仪器，因此，针对PEDV敏感性强、特异性高并能应用于基层临床的快速诊断方法的建立是十分必要的。S蛋白为PEDV的主要结构蛋白，对介导中和抗体的产生起重要作用，同时也是病毒刺激机体产生免疫保护的重要结构蛋白，是研制新型诊断试剂的重要前提。ELISA法是目前应用比较广泛的检测方法之一，其具有简单易操作等特点但是耗时较长，胶体金免疫层析技术作为一种新的简单快速准确直观的检测方法正在为大家所熟知，结合单克隆抗体技术又具有良好的特异性和敏感性。用杂交瘤细胞生产单克隆抗体（MonoclonalAntibody,McAb）是近年来在免疫学和分子生物学领域中显著成就之一，自1975年报道了淋巴细胞杂交瘤技术依赖，其理论和试用研究取得了惊人的进展。McAb纯度高，专一性强、重复性好且能在动物体外或体内产生同质性抗体，较常规的免疫学方法优越，为标准化提供了机会。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株及其应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCCNO：C201660，保藏日期：2016年4月21日。本专利技术还提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上所述的杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生。本专利技术所述的单克隆抗体，其中，在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。本专利技术所述的单克隆抗体，其中，是由以下方法制备而获得的：（1）免疫小鼠取6-8周龄BALB/c小鼠用纯化的PEDVS蛋白（636-789aa片段）加等量弗氏完全佐剂进行腹腔免疫，首免每只小鼠50ug；2周后用弗氏不完全佐剂乳化，剂量同前，经皮下多点注射加强免疫2次；2周后腹腔注射，剂量同前；从免疫后3周开始进行小鼠断尾采血测抗体效价（ELISA），四免10天后选择ELISA效价最高的小鼠准备融合，融合前3天加强免疫1次；（2）ELISA方法建立以纯化的PEDVS蛋白（636-789aa片段）为包被抗原，HRP标记羊抗鼠为二抗，建立PEDVS蛋白间接ELISA方法；（3）细胞融合（3.1）饲养细胞的准备取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；（3.2）致敏脾细胞的准备将免疫后的小鼠处死后置于75%酒精浸泡10min；无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；放置在不锈钢网上，用注射器加DMEM培养液助推器轻轻研磨脾脏，获细胞悬液；将细胞悬液转移至12ml离心管中，1000rpm，10min，备用；（3.3）融合细胞按常规方法融合，取预先准备好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和免疫鼠脾细胞以（5-10）：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基；轻轻使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热，然后取1ml40℃预热的50%PEG3500作为融合剂，缓慢滴加至细胞混合物中，时间控制在1min内，静置融合2min,然后用无血清的DMEM培养基终止融合，经1500rpm，5min，沉淀用HAT培养基重悬，分别接种于96孔培养板中，100μl/孔，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，3天后观察细胞融合情况，适当换液，融合14d后，取细胞培养上清液以备检测；（4）杂交瘤细胞的筛选按照此前所建立的间接ELISA方法检测细胞培养上清液，筛选阳性细胞克隆株，阳性对照为免疫小鼠血清，阴性对照为SP2/0细胞培养上清液，杂交瘤细胞培养上清液为一抗，二抗使用HRP标记的羊抗鼠IgG；使用间接免疫荧光法对细胞上清进行进一步的检测：将ELISA检测阳性的10株杂交瘤细胞的上清进行间接免疫荧光法的筛选，即筛选能够识别PEDV病毒表达立体构象的单抗；杂交瘤细胞培养上清液为一抗，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG，置于荧光倒置显微镜观察结果；结果显示只有一株杂交瘤细胞株的细胞上清可以检测到PEDV在Vero细胞上的感染，即7D3F11杂交瘤细胞株；（5）有限稀释法克隆杂交瘤细胞通过有限稀释方法（limiteddilutionmethod）来进行克隆；将细胞接种至96孔板并培养，随后对包含1个集落的孔的培养物上清液进行ELISA检测筛选，筛选阳性细胞克隆，反复进行有限稀释，直到筛选到杂交瘤细胞株7D3F11，并进行扩大培养及冻存；（6）单克隆抗体的制备分别将BALB/C小鼠腹腔注射完全弗氏佐剂，注射剂量0.5ml/只，2周后，分别将5株杂交瘤细胞株7D3F11按106个/只的剂量注射到小鼠腹腔内，每天观察小鼠腹部的变化，待腹部膨大后，用注射器采集腹水，收获的腹水经3000rpm离心10min后，收集上清液，即得单克隆抗体。本专利技术所述的单克隆抗体，其中，步骤（2）ELISA方法的建立如下：经方阵试验测到PEDV重组S蛋白抗原包被浓度为5ug/孔，酶标羊抗鼠IgG的工作浓度为1：2000，培养上清的作用时间为1h，底物显色时间为20min。本专利技术所述的单克隆抗体，其中，步骤（3.1）的取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，具体操作如下：将正常的BALB/c小鼠处死后置于75%酒精浸泡10min；将小鼠固定于解剖台上，手术剪在小鼠腹部皮肤开一个小口，用镊子慢慢剥离皮肤，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201660。
【技术特征摘要】
1.一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCCNO：C201660。2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，是由以下方法制备而获得的：(1)免疫小鼠取6-8周龄BALB/c小鼠用纯化的PEDVS蛋白(636-789aa片段)加等量弗氏完全佐剂进行腹腔免疫，首免每只小鼠50ug；2周后用弗氏不完全佐剂乳化，剂量同前，经皮下多点注射加强免疫2次；2周后腹腔注射，剂量同前；从免疫后3周开始进行小鼠断尾采血测抗体效价(ELISA)，四免10天后选择ELISA效价最高的小鼠准备融合，融合前3天加强免疫1次；(2)ELISA方法建立以纯化的PEDVS蛋白(636-789aa片段)为包被抗原，HRP标记羊抗鼠为二抗，建立PEDVS蛋白间接ELISA方法；(3)细胞融合(3.1)饲养细胞的准备取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；(3.2)致敏脾细胞的准备将免疫后的小鼠处死后置于75％酒精浸泡10min；无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；放置在不锈钢网上，用注射器加DMEM培养液助推器轻轻研磨脾脏，获细胞悬液；将细胞悬液转移至12ml离心管中，1000rpm，10min，备用；(3.3)融合细胞按常规方法融合，取预先准备好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和免疫鼠脾细胞以(5-10)：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基；轻轻使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热，然后取1ml40℃预热的50％PEG3500作为融合剂，缓慢滴加至细胞混合物中，时间控制在1min内，静置融合2min,然后用无血清的DMEM培养基终止融合，经1500rpm，5min，沉淀用HAT培养基重悬，分别接种于96孔培养板中，100μl/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，3天后观察细胞融合情况，适当换液，融合14d后，取细胞培养上清液以备...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，王亚欣，赵大伟，唐满华，
申请(专利权)人：广东温氏大华农生物科技有限公司，华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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