根癌农杆菌和CRISPR‑Cas9介导的基因定点插入失活方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种根癌农杆菌和CRISPR‑Cas9介导的基因定点插入失活方法，使用甘蔗鞭黑穗菌内源snRNA启动子(甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子)驱动sgRNA表达盒，将CRISPR‑Cas9系统与根癌农杆菌T‑质粒整合，构建以潮霉素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的甘蔗鞭黑穗菌基因定点插入载体失活系统；将目标基因的特异识别序列克隆入sgRNA表达盒，用于转化甘蔗鞭黑穗菌担孢子，从而将载体系统的可跳动DNA片段准确插入甘蔗鞭黑穗菌目标基因靶标序列，达到破坏基因功能的目的。本发明专利技术为研究甘蔗鞭黑穗菌的功能基因组学提供了重要工具，该系统具有高效性和准确性，方便在甘蔗鞭黑穗菌中进行基因功能的研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物基因工程领域中用于真菌基因敲除的分子工具及实验体系，尤其涉及一种根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法及其应用。
技术介绍
甘蔗鞭黑穗菌(Sporisoriumscitamineum)是甘蔗黑穗病的病原菌，属担子菌亚门黑粉菌属。由其引起的甘蔗黑穗病是一个全球性病害，对我国甘蔗生产造成巨大危害。甘蔗鞭黑穗菌生命周期有三个不同的阶段：类酵母菌单倍体，双核菌丝和二倍体冬孢子。基因失活技术是通过改变生物的遗传基因，令特定的基因序列发生改变，导致基因失活并丧失功能，进而推测出该基因生物学功能的一种遗传工程技术。常用的基因失活技术是通过DNA转化，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组，将载体DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而改变细胞遗传特性。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤杆菌，在自然条件下，它能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将其染色体外遗传物质Ti质粒段DNA(T-DNA)大多以单拷贝形式随机整合进植物的基因组中。许多研究表明根癌农杆菌不仅可以转化植物而且可以转化细菌、动物和真菌。因此，通过这一原理，利用农杆菌介导将外源DNA片段转化至靶细胞中已成为研究植物、真菌甚至动物功能基因的一种常用反向遗传学技术。CRISPR/Cas是一种新兴的基因定点编辑技术，在该系统中通过形成具有引导作用的sgRNA(singleguideRNA)引导核酸酶Cas9蛋白在靶位点切割双链DNA，再通过非同源末端连接进行DNA双链断裂修复，在此修复过程中可进行序列编辑或小片段缺失而造成基因序列的改变从而起到对基因的编辑或敲除。迄今为止，在甘蔗鞭黑穗菌中尚无法通过转化原生质体的方法进行有效的遗传操作，只能依赖农杆菌介导的转化导入外源DNA片段，而农杆菌介导的外源DNA片段转化具有随机性，无法对特定位点进行精确插入。因此，有必要开发一套适用于甘蔗鞭黑穗菌的高效基因定点插入技术，为进一步研究甘蔗鞭黑穗菌的基因功能及其致病机制提供便利。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子，具有序列表SEQ.ID.No.17的碱基序列。上述甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子用于在甘蔗鞭黑穗菌中转录出载体上位于U6启动子下游sgRNA序列。上述甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子在CRISPR-Cas9基因失活及编辑系统中的应用。根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法，使用甘蔗鞭黑穗菌内源snRNA启动子驱动sgRNA表达盒，将CRISPR-Cas9系统与根癌农杆菌T-质粒整合，构建以潮霉素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的甘蔗鞭黑穗菌基因定点插入载体失活系统；将目标基因的特异识别序列克隆入sgRNA表达盒，用于转化甘蔗鞭黑穗菌担孢子，从而将载体系统的可跳动DNA片段准确插入甘蔗鞭黑穗菌目标基因靶标序列。根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法，通过将甘蔗鞭黑穗菌内源U6基因启动子与所插入位点靶标序列以及sgRNA序列经OverlappingPCR融合后，经In-fusion技术重组至带有由甘蔗鞭黑穗菌内源gapd基因启动子驱动的Cas9基因及潮霉素抗性基因的双元载体中；再由携带该双元载体的根癌农杆菌介导转化甘蔗鞭黑穗菌从而达到对甘蔗鞭黑穗菌基因组的定点插入；甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子具有序列表SEQ.ID.No.17的碱基序列。根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法在甘蔗鞭黑穗菌JG35野生型菌株中对mfa2、prf或g827基因进行基因失活中的应用。专利技术人研究了甘蔗鞭黑穗菌基因失活技术，计划依靠靶向序列引导及农杆菌介导，在甘蔗鞭黑穗菌基因组中定点插入外源片段高效地进行基因敲除，构建目标基因的敲除突变株。为此，专利技术人建立了一种根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法，使用甘蔗鞭黑穗菌内源snRNA启动子驱动sgRNA表达盒，将CRISPR-Cas9系统与根癌农杆菌T-质粒整合，构建以潮霉素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的甘蔗鞭黑穗菌基因定点插入载体失活系统；将目标基因的特异识别序列克隆入sgRNA表达盒，用于转化甘蔗鞭黑穗菌担孢子，从而将载体系统的可跳动DNA片段准确插入甘蔗鞭黑穗菌目标基因靶标序列，达到破坏基因功能的目的。通过在甘蔗鞭黑穗菌基因组中进行实验，专利技术人发现了具有功能的甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子，其可在甘蔗鞭黑穗菌中转录出载体上位于U6启动子下游sgRNA序列，用于在上述基因定点插入失活方法中执行基本的转录功能。通过本专利技术在甘蔗鞭黑穗菌JG35野生型菌株中分别对mfa2(mfa2cds，SEQ.ID.No.21；MFA2，SEQ.ID.No.22)、prf(prfcds，SEQ.ID.No.23；PRF，SEQ.ID.No.24)和g827(g827cds，SEQ.ID.No.25；G827，SEQ.ID.No.26)等3个基因进行基因失活，分别构建三个基因的敲除突变株。在敲除mfa2基因时，对随机挑选的具有潮霉素抗性的46个转化子进行PCR鉴定，其中发生外源片段定点插入的转化子为18个，外源片段定点插入率为39％，即靶基因失活率为39％。在敲除prf基因时，对随机挑选的具有潮霉素抗性的23个转化子进行PCR鉴定，其中发生外源片段定点插入的转化子为5个，外源片段定点插入率为21.7％，即靶基因失活率为21.7％。在敲除g827基因时，对随机挑选的具有潮霉素抗性的23个转化子进行PCR鉴定，其中发生外源片段定点插入的转化子为3个，外源片段定点插入率为13％，即靶基因失活率为13％。实验表明，通过根癌农杆菌介导的CRISPR-Cas9定点插入技术可在甘蔗鞭黑穗菌中对目标基因进行定点插入而达到基因失活的目的，进而对基因功能进行研究；而且基因失活效率显著高于目前常用的同源双交换基因打靶的效率。由农杆菌T-DNA/CRISPR/Cas9组合介导的定点插入的这一现象在其他物种中尚无报道。本专利技术高效基因失活系统的建立，为研究甘蔗鞭黑穗菌的功能基因组学提供了重要工具，该系统具有高效性和准确性，方便在甘蔗鞭黑穗菌中进行基因功能的研究。以甘蔗鞭黑穗菌编码信息素基因mfa2为例，本专利技术利用农杆菌介导的CRISPR-Cas9定点插入技术在mfa2基因中定点插入整合有CRISPR-Cas9的T-DNA序列，破坏了mfa2基因，从而导致该基因功能的缺失(图4)。甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因编码信息素，信息素在单倍体菌株配合过程中具有重要的作用。正负交配型的野生型甘蔗鞭黑穗菌JG35和JG36未配合是呈酵母状(图6B)，两者可以通过配合在平板上形成白色绒毛状菌落(图6C)，而被外源片段插入后的mfa2基因功能丧失从而导致转化子无法与野生型JG36菌株配对形成白色绒毛状菌落(图6A)。本专利技术通过设计引物对转化子进行筛选鉴定(图5)，可明确外源片段插入的方向(图7)由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.17的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.17的碱基序列。2.权利要求1所述甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子用于在甘蔗鞭黑穗菌中转录出载体上位于U6启动子下游sgRNA序列。3.权利要求1所述甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子在CRISPR-Cas9基因失活及编辑系统中的应用。4.一种根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法，其特征在于：使用甘蔗鞭黑穗菌内源snRNA启动子驱动sgRNA表达盒，将CRISPR-Cas9系统与根癌农杆菌T-质粒整合，构建以潮霉素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的甘蔗鞭黑穗菌基因定点插入载体失活系统；将目标基因的特异识别序列克隆入sgRNA表达盒，用于转化甘蔗鞭黑穗菌担孢子，从而将载体系统的可跳动DNA片段准确插入...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈保善，卢姗，吕哲，姚颜萍，沈笑瑞，蔡晓薇，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45