利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法，引物的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述方法包括：抽提样品的基因组DNA；提供扩增人KRAS基因多态性rs712位点附近序列的正向引物和反向引物，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；使用限制性内切酶TaqI进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定KRAS基因多态性rs712的各基因型。本发明专利技术的方法重复性好，操作较简单，成本低，酶切结果容易辨识，适用范围广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因多态性检测
，尤其涉及一种利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法。
技术介绍
近年来，食管癌是世界第六大常见恶性肿瘤死因，在特殊地区的发病率呈上升趋势。我国的食管癌发病率居世界首位，食管癌死因在全国恶性肿瘤死因中位居第四，死亡人数占全国恶性肿瘤死亡人数的1/5。近年的研究表明，食管癌的发生和发展是多因素共同作用的结果，其发生和发展除与长期吸烟、饮酒、亚硝胺类及霉菌的摄人、膳食中缺乏维生素及微量元素(如钼)、热损伤(喜食烫食)等环境因素有关外，与个体遗传易感性也有密切关系。KRAS(KRASproto-oncogene)基因位于12号染色体上，是表皮生长因子受体(EGFR)功能信号的下游分子，在膜受体到腺苷环化酶信号转导中起重要作用。KRAS基因通过激活RAF/MEK/MAPK通路促进癌症的发生。KRAS基因的突变与多种癌症的发生相关，在癌症的发生、转移和进展中发挥着重要作用。这些突变位点，一个氨基酸的替换可以导致一个激活突变或者使KRAS的表达增加。研究发现miRNAlet-7与KRAS3’端非翻译区的结合位点的多态性位点rs712与结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和口腔癌等多种癌症相关。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是人类长期进化过程中环境选择的结果，已成为第3代分子遗传的标记，具有标记密度高、稳定、易于分型检测的优势，是人种之间、个体之间差异的遗传基础之一，已确定为多种遗传学相关疾病的易感基础，成为患病危险程度的评价指标。目前进行SNP基因型检测的方法有多种，金标准为基因测序法，这是目前最准确的检测方法，但该方法需要昂贵的仪器设备和专业人员进行操作，费时费力，很难推广。芯片法具有快速高通量的优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。序列特异性引物PCR也称等位基因特异性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于TaqDNA多聚酶不能修复DNA引物在3′末端的单个碱基错配。所以，当引物的3′端核苷酸与等位基因变异部位序列互补，则模板被扩增。但是，当引物3′端核苷酸与模板错配，则模板不会被扩增或扩增效率极低。每个等位基因的检测，需设计两套引物，一套为等位基因特异性引物，一套为普通引物。PCR产物凝胶电泳以后，通过紫外线透射来检测DNA的存在与否，DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。在同一反应中的另一对引物(通常扩增人生长激素基因的一段)总会产生一个DNA片断，与SNP基因型无关，作为PCR有效性的控制。基因特异性PCR(AS-PCR)的缺点是扩增效率较低，扩增特异性差，因此PCR产物的特异性与稳定性无法保障，同时，分型结果也较容易误判，稳定性较差。TaqMan探针法是指PCR扩增时，在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。Taqman荧光探针法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高，难以在实验室中普及使用。SNaPshot也被称为minisequencing。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Genemapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下，根据模板的；序列，只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核苷酸的种类。SNaPshot基因型分析方法的缺点在于所需试剂必须从国外进口，而且成本较高，不适合实验室应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用TaqI检测食管癌易感性基因KRAS多态性位点rs712的方法，旨在解决现有的食管癌易感基因多态性检测方法，克服操作复杂、需昂贵的仪器和繁琐的步骤、检测成本较高、适用范围小、难以在实验室中普及使用的问题。本专利技术是这样实现的，一种引物，所述引物的序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述引物的利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法，所述利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法包括以下步骤：步骤一，抽提样品的基因组DNA；步骤二，提供扩增人KRAS基因多态性rs712位点附近序列的正向引物和反向引物，上游引物:5’-GCAGACTGTTAGCTTTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；步骤三，使用限制性内切酶TaqI进行酶切，获取相应的酶切产物；步骤四，将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定KRAS基因多态性rs712的各基因型。其中，经电泳后有一条条带者为野生型TT基因型，两条条带者为纯合突变GG基因型，三条条带者为杂合基因型TG基因型。进一步，所述PCR扩增的体系反应条件：在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在94℃变性，再迅速冷却至57℃，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。进一步，所述利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法包括以下步骤：(l)获取手术切取的食管癌组织，采用酚-氯仿法提取食管癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：1)将食管癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次；2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜；3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液1:1，剧烈震荡，使其变成奶咖色，12000rpm离心10min；4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体，加入等体积的氯仿后颠倒混匀，12000rm离心10min；5)取上清，加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清；6)加入1ml70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物，其特征在于，所述引物的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于，所述引物的序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。2.一种应用权利要求1所述引物的利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法，其特征在于，所述利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法包括以下步骤：步骤一，抽提样品的基因组DNA；步骤二，提供扩增人KRAS基因多态性rs712位点附近序列的正向引物和反向引物，上游引物:5’-GCAGACTGTTAGCTTTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；步骤三，使用限制性内切酶TaqI进行酶切获取相应的酶切产物；步骤四，将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定KRAS基因多态性rs712的各基因型，其中，经电泳后有一条条带者为野生型TT基因型，两条条带者为纯合突变GG基因型，三条条带者为杂合基因型TG基因型。3.如权利要求2所述的利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系反应条件：在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在94℃变性，再迅速冷却至57℃，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。4.如权利要求2所述的利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法，其特征在于，所述利用TaqI鉴定食管癌易感基因KRAS多态性的方法包括以下步骤：(l)获取手术切取的食管癌组织，采用酚-氯仿法提取食管癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：1)将食管癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次；2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜；3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液1:1，剧烈震荡，使其变成奶咖色，12000rpm离心10min；4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体，加入等体积的氯仿后颠倒混匀，12000rm离心10min；5)取上清，加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清；6)加入1ml70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净；7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得食管癌组织基因组DNA；(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用PrimerPremier6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-GCAGACTGTTAGCTTTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括30个循环三个步骤，首先94℃变性30s，57℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为384bp的PCR扩增产物；(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶TaqI5U水浴锅中酶切6-14h，PCR反...

【专利技术属性】
技术研发人员：代丽萍，谢伟，赵瑛瑛，段富交，张有改，渠彦红，王凯娟，王鹏，张建营，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41