新型过氧化氢酶信号序列及利用其的过氧化氢酶表达方法技术

本发明专利技术涉及用于大量表达过氧化氢酶的新型信号序列及其用途，更具体地，涉及新型脂肪酶信号序列、包含所述信号序列和过氧化氢酶基因的表达载体、导入有所述表达载体的重组微生物以及通过培养所述重组微生物来大量生产过氧化氢酶的方法。根据包含本发明专利技术的新型信号序列的表达载体，不仅可以诱导特定过氧化氢酶的大量表达及分泌，还可以诱导其它靶蛋白的大量表达及分泌，从而非常有利于特定过氧化氢酶及其它靶蛋白的稳定的大量生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于大量表达过氧化氢酶的新型信号序列及其用途，更具体地，涉及新型脂肪酶信号序列、包含所述信号序列和过氧化氢酶基因的表达载体、导入有所述表达载体的重组微生物以及通过培养所述重组微生物来大量生产过氧化氢酶的方法。
技术介绍
过氧化氢酶是促进过氧化氢(H2O2)转换为氧(O2)和水(H2O)的酶。大部分的过氧化氢酶酶包含4种多肽亚单位，所述4种多肽亚单位分别具有50000至60000的分子量，每个亚单位具有一个血红素(Heme)(WassermanandHultin(1981)Arch.Biochem.Biophys.212:385-392；HartigandRuis(1986)Eur.J.Biochem.160:487-490)。一直以来，通过使用稳定性已经被广泛知晓的酵母(Saccharomyces)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)来制备作为工业用的多种蛋白质，并且，为了表达及分泌靶蛋白，使用由作为转录激活序列的启动子(promoter)、对分泌信号序列进行编码的DNA(脱氧核糖核酸)、靶蛋白的结构基因及转录终止子(transcriptionterminator)形成的表达分泌质粒载体。目前，作为为了从黑曲霉分泌靶蛋白而使用的分泌信号序列，有所要表达的基因的自身信号序列和黑曲霉葡糖糖化酶信号序列，作为强有力启动子，有葡糖糖化酶(glaA)启动子。但是，当前仅通过目前已知的信号序列无法大量表达所需的蛋白质。因此，目前迫切需要能够更有效地大量生产作为产业上重要的酶的过氧化氢酶的信号序列，且对该信号序列的需要正持续增加。为此，为了克服所述表达的局限，本专利技术人利用基因工程学方法悉心研究开发了能够大量生产过氧化氢酶的方法，其结果，发掘了用于表达过氧化氢酶的新型信号序列，并确认了在利用所述信号序列的情况下，能够大量表达过氧化氢酶，由此完成了本专利技术。在本技术背景部分中记载的上述信息，仅用于提高对本专利技术背景的理解，因此，有可能不包含对于本专利技术所属
的普通技术人员而言构成已公知的现有技术的信息。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供用于大量表达过氧化氢酶的新型脂肪酶信号序列、包含所述信号序列和过氧化氢酶基因的表达载体、导入有所述表达载体的重组微生物。本专利技术的另一目的在于，提供通过培养所述重组微生物来大量生产过氧化氢酶的方法。为了达成上述目的，本专利技术提供由序列号1的氨基酸序列表示的An07g00440脂肪酶信号序列及由序列号2的氨基酸序列表示的变形脂肪酶信号序列。并且，本专利技术提供包含对所述信号序列进行编码的核酸和靶蛋白基因的表达载体，以及导入有所述表达载体的重组微生物。并且，本专利技术提供靶蛋白的制备方法，其特征在于，包括：步骤(a)，培养所述重组微生物来生成靶蛋白；以及步骤(b)，回收所生成的所述靶蛋白。附图说明图1为本专利技术的表达载体的示意图。A部分为详细示出克隆并插入外来基因的cDNA(互补脱氧核糖核酸)时的启动子、信号序列、外来基因及前者终止密码子的各个部分的示意图，B部分为还包含An07g00440脂肪酶信号序列时的示意图，C部分为还包含An07g00440脂肪酶变形信号序列时的示意图。图2为表示实施例1-实施例2的表达载体的图。A部分表示使用glaA启动子和pdcA终止因子且可克隆包含自身信号序列的cDNA的载体(pASP503)，B部分表示使用glaA启动子和pdcA终止因子且包含An07g00440脂肪酶信号序列的载体(pASPW504)，C部分表示使用glaA启动子和pdcA终止因子且包含An07g00440脂肪酶变形信号序列的载体(pASPV505)。图3为表示实施例5的重组微生物培养液分析结果的图，A部分表示重组微生物pASPF503PMC的培养液分析结果，B部分表示重组微生物pASPW504PMC的培养液分析结果，C部分表示重组微生物pASPV505PMC的培养液分析结果。具体实施方式除非另有定义，本说明书中所使用的所有技术及科学术语，具有与本专利技术所属
的普通技术人员的常规理解相同的含义。通常，在本说明书中使用的命名法是本
中的常规使用法。在本专利技术中，制备了可大量表达特定过氧化氢酶和其它靶蛋白的An07g00440脂肪酶信号序列、以及变形脂肪酶信号序列；包含所述信号序列和靶蛋白基因的表达载体；以及导入有所述表达载体的重组微生物。其结果，确认到通过培养所制备的重组微生物可大量生产过氧化氢酶。在本专利技术的一实施例中，作为对靶蛋白进行编码的核酸使用序列号6的马尔尼菲青霉过氧化氢酶基因，并使用本专利技术的新型信号序列的情况下，确认到可大量生产过氧化氢酶。但是，所述实施例仅为例示性实施例，本专利技术不仅适用于特定过氧化氢酶，还可以适用于其他靶蛋白。因此，本专利技术的一实施方式，涉及由序列号1的氨基酸序列表示的An07g00440脂肪酶信号序列及对所述信号序列进行编码的核酸。本专利技术的特征在于，所述An07g00440脂肪酶信号序列来自黑曲霉(Aspergillusniger)，但并不限定于此。本专利技术的特征在于，对所述信号序列进行编码的核酸由序列号3的碱基序列表示，但并不限定于此。本专利技术的另一实施方式，涉及由序列号2的氨基酸序列表示的变形脂肪酶信号序列及对所述变形脂肪酶信号序列进行编码的核酸，所述变形脂肪酶信号序列的特征在于，作为所述An07g00440脂肪酶信号序列的第二个氨基酸的酪氨酸(tyrosine；T)被带正电荷的精氨酸(arginine；R)取代，作为第三个氨基酸的异亮氨酸(isoleucine；I)被色氨酸(tryptophane；T)取代。本专利技术的特征在于，对所述变形脂肪酶信号序列进行编码的核酸由序列号4的碱基序列表示，但并不限定于此。本专利技术的又一实施方式，涉及包含对所述脂肪酶信号序列进行编码的核酸及靶蛋白基因的表达载体。在本专利技术中，“载体(vector)”是指包含DNA(脱氧核糖核酸)序列的DNA产品，所述DNA序列可运转地连接于能够在适合的宿主内表达DNA的适合的调节序列上。载体可以为质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在性基因组插入物。若转化成适当的宿主，则可使载体与宿主基因组无关地实现复制及作用，或者在部分情况下可整合在基因组自身。质粒为目前载体的最常见的使用形态，因此，在本专利技术的说明书中，“质粒(plasmid)”及“载体(vector)”有时可互换使用。从本专利技术的目的考虑，优选地使用质粒载体。可使用于这种目的的典型质粒载体，具有包括：(a)复制起始点，以使每个宿主细胞包含数百个质粒载体的方式有效地实现复制；(b)抗生素耐药性基因，以使转化成质粒载体的宿主细胞被筛选；以及(c)限制酶切断部位，以使外来DNA片段插入；的结构。即使不存在适当的限制酶切断部位，通过使用常规方法的合成寡核苷酸连接物(oligonucleotideadaptor)或交联剂(linker)，也可使载体和外来DNA容易地连接(ligation)。并且，当所述基因和其它核酸序列以功能性关系配置时，可实现“可运转地连接(operablylinked)”。这可以为适当的分子(例如，转录激活蛋白)与(多个)调节本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪酶信号序列，其特征在于，由序列号1的氨基酸序列表示。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.27 KR 10-2014-00639771.一种脂肪酶信号序列，其特征在于，由序列号1的氨基酸序列表示。2.根据权利要求1所述的脂肪酶信号序列，其特征在于，所述脂肪酶信号序列来自黑曲霉。3.一种核酸，其特征在于，对权利要求1所述的脂肪酶信号序列进行编码。4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸由序列号3的碱基序列表示。5.一种由序列号2的氨基酸序列表示的变形脂肪酶信号序列，其特征在于，作为权利要求1所述的脂肪酶信号序列的第二个氨基酸的酪氨酸被带正电荷的精氨酸取代，作为第三个氨基酸的异亮氨酸被色氨酸取代。6.一种核酸，其特征在于，对权利要求5所述的变形脂肪酶信号序列进行编码。7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，所述核酸由序列号4的碱基序列表示。8.一种表达载体，其特征在于，包含对权利要求1或5所述的脂肪酶信号序列进行编码的核酸及靶蛋白基因。9.根据权利要求8所...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘在龟，金义中，李东范，金恩英，
申请(专利权)人：杰诺福克斯公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR