一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，包括以下步骤：a）PEG与甲基丙烯酰氯制备PEGDMA并纯化；b）分离人间充质干细胞；c）将人间充质干细胞传代并调整密度，待细胞贴壁后更换诱导培养基培养；d）清洗牛股骨，在骨软骨栓塞的中心位置用无菌活体穿孔器做出全层软骨缺损，将骨软骨栓塞置于DMEM中培养成3D生物纸；e）将纯化的PEGDMA溶解，加入光引发剂2959，将步骤ｃ）诱导所得软骨细胞重悬在过滤除菌的PEGDMA溶液中制成生物墨水；f）将生物打印机消毒灭菌后加入生物墨水，按照设计的形状和大小在3D生物纸上打印出3D软骨，将3D软骨置于诱导培养基中培养。本发明专利技术的优点在于：操作简单快速且准确，细胞毒性小，非常有希望成为临床软骨修复的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程
，特别涉及一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法。
技术介绍
骨关节炎、衰老以及关节损伤等原因导致的软骨缺损是关节痛和慢性残疾的主要原因之一。由于缺乏血管、神经和淋巴，成熟软骨不能自愈。目前最常用于晚期软骨退化的治疗方法是关节置换术，但是该手术本身操作复杂，常引起周围组织感染，并且手术费用也非常昂贵。尽管基于细胞移植的组织工程疗法在二十多年前已被引进，但目前软骨组织工程策略还不能制造出和天然软骨一样的组织，包括层次结构、细胞外基质和机械性能。另外，几乎所有的膝盖软骨修复方法都有一个步骤：将损伤部位周围的健康软骨组织移除，以产生一定形状的人工缺损，便于后期的治疗和移植。该步骤实际上对现存的软骨造成了额外的坏死并最终导致了软骨退化和组织移植失败。基于组织工程的直接软骨修复方法非常具有吸引力，因为该方法是直接对缺损部位进行修复，而不会导致周围健康组织额外的损伤。理想的移植组织需要和天然软骨很好的整合并对不同大小和厚度的损伤部位进行修复。因此，需要开发新的技术，使工程化组织能够与损伤部位不同的形状和性质相匹配。喷墨打印是非接触式打印技术，在基底上通过微墨滴的形式复制数模信息。打印前加热产生热量，进而气化墨水产生气泡，由此产生的压力使墨滴以不同体积（10-150pL）喷射。在打印过程中，尽管每个喷嘴处的加热元件使局部温度上升到300℃并持续几微秒，但哺乳动物细胞只被加热2微秒，温度超过外界环境4-10℃，90%的细胞任能够保持活力。随着高通量数控技术的发展和对细胞、生长因子和生物材料支架的高精度定位，目前已经有研究组用生物打印的方法成功制造出了具有生物功能的人类微血管。生物材料支架的产生通常是将粘性较小的生物墨水喷射到粘性较大的生物纸上。研究表明，由聚乙二醇（PEG）大分子单体合成的水凝胶可以保持软骨细胞的活力并促进细胞外基质的沉积，如蛋白聚糖和II型胶原。PEG水凝胶的压缩模量与人软骨的压缩模量相仿，和天然组织具有生物相容性，不会引发强免疫排斥。另外，PEG是水溶性的，粘度低，可以通过光交联方法进行修饰。因此，在生物打印中，PEG可以作为生物支架材料用于自发聚合。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，该方法可以按照软骨部位缺损形状、大小以及性质快速而准确的制造相应的组织，最终用于修复人软骨缺损。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，其创新点在于：包括以下步骤：a）PEG与甲基丙烯酰氯过夜反应制备PEGDMA并纯化；b）采用全骨髓贴壁法分离人间充质干细胞；c）将生长状态良好的人间充质干细胞传代并调整密度，待细胞贴壁后更换诱导培养基培养；d）清洗新鲜牛股骨，在骨软骨栓塞的中心位置用无菌活体穿孔器做出全层软骨缺损，将骨软骨栓塞置于DMEM中培养成3D生物纸；e）将纯化的PEGDMA溶解，加入光引发剂2959，将步骤ｃ）诱导所得软骨细胞重悬在过滤除菌的PEGDMA溶液中制成生物墨水；f）将生物打印机消毒灭菌后加入生物墨水，按照设计的形状和大小在3D生物纸上层层打印出3D软骨，将3D软骨置于诱导培养基中培养。进一步的，步骤ａ）中采用3kDa的PEG与甲基丙烯酰氯在氮气条件下过夜反应，再通过乙醚析出和过夜冻干的方法进行纯化，使合成的PEGDMA大分子单体纯度大于95%。进一步的，步骤ｂ）中分离人间充质干细胞包括在无菌条件下取健康成人骨髓液，用PBS漂洗并计数，将处理后的细胞培养在含20%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素的α-MEM基础培养基中，置于37℃、5%(v/v)CO2的细胞培养箱培养，48小时后换液，之后每隔3天换液。进一步的，步骤ｃ）中人间充质干细胞密度调整至5×103个/cm2，所述诱导培养基含1×胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠，0.1mmol/L抗坏血酸磷酸盐,1.25mg/mL人血清白蛋白,10-7mol/L地塞米松,1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素,10ng/mLTGF-b1，将所述诱导培养基置于37℃、5%（v/v）CO2的细胞培养箱，每3天更换一次诱导培养基，培养2-6周。进一步的，步骤ｄ）中无菌活体穿孔器直径为4mm，缺损的深度为2-5mm，所述DMEM含有10%(v/v)小牛血清和1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素，培养温度37℃，将DMEM置于5%(v/v)CO2的细胞培养箱。进一步的，步骤ｅ）中PEGDMA溶解在PBS或去离子水中，浓度为10%(w/v)和20%(w/v)，光引发剂2959的加入量为0.05%(w/v)，所述生物墨水中每毫升溶液含5×106个细胞。进一步的，步骤ｆ）中生物打印机用紫外照射灭菌，打印笔用70%(v/v)乙醇消毒，打印时将UV强度为4.5mW/cm2的长波紫外灯置于打印平台上方25cm处，打印笔中加满步骤ｅ）制得的生物墨水并用铝箔覆盖以防止紫外照射，打印出的出3D软骨在诱导培养基中分别培养2、4、6周，每3天更换一次培养基。本专利技术的优点在于：1）可以按照组织受损部位的大小和形状制造出合适的软骨移植物；2）可以准确的控制单个细胞和生物材料支架的位置；3）对细胞损伤小有利于维持软骨表型；4）采用热喷墨打印机和自发光聚合反应将组织工程制造的时间大大缩短。本专利技术操作简单快速且准确，细胞毒性小，非常有希望成为临床软骨修复的方法。附图说明图1为本专利技术一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法的过程示意图。图2为本专利技术生物打印关节软骨的COL2A1基因表达水平柱状图。图3为本专利技术生物打印关节软骨的ACAN基因表达水平柱状图。图4为本专利技术生物打印关节软骨的COL1A1基因表达水平柱状图。具体实施方式如图1所示，本专利技术公开了一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，包括以下步骤：PEGDMA的制备将3kDa的PEG（聚乙二醇）溶解在四氢呋喃中，在氮气条件下使PEG与甲基丙烯酰氯过夜反应。通过乙醚析出和过夜冻干的方法纯化合成的PEGDMA（聚乙二醇二甲基丙烯酸酯）大分子单体，采用质子核磁共振法检测，确保合成的PEGDMA大分子单体纯度大于95%。人间充质干细胞分离无菌条件下取健康成人骨髓液，加入等体积PBS，用吸管吹打分散细胞。室温下取300g骨髓PBS混合液离心5min，收集细胞。用PBS重悬细胞，进行计数。室温下取300g骨髓PBS混合液离心5min，收集细胞，用含20%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)PSG（青霉素-链霉素-庆大霉素）的α-MEM基础培养基重悬细胞，将细胞以1.6×105个/cm2的密度接种于培养瓶中，置于37℃、5%(v/v)CO2的细胞培养箱培养，48小时后换液，之后每隔3天换液。体外扩增到第二代后，将干细胞传代，调整密度至5×103个/cm2，培养24小时使细胞贴壁。将基础培养基更换为诱导培养基DMEM，置于37℃、5%(v/v)CO2的细胞培养箱培养，每3天更换一次诱导培养基，培养2-6周。所述诱导培养基DMEM含1×胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠(ITS-A)，0.1mmol/L抗坏血酸磷酸盐,1.25mg/mL人血清白蛋白,10-7m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，其特征在于：包括以下步骤：PEG与甲基丙烯酰氯过夜反应制备PEGDMA并纯化；采用全骨髓贴壁法分离人间充质干细胞；将生长状态良好的人间充质干细胞传代并调整密度，待细胞贴壁后更换诱导培养基培养；清洗新鲜牛股骨，在骨软骨栓塞的中心位置用无菌活体穿孔器做出全层软骨缺损，将骨软骨栓塞置于DMEM中培养成3D生物纸；将纯化的PEGDMA溶解，加入光引发剂2959，将步骤ｃ）诱导所得软骨细胞重悬在过滤除菌的PEGDMA溶液中制成生物墨水；将生物打印机消毒灭菌后加入生物墨水，按照设计的形状和大小在3D生物纸上层层打印出3D软骨，将3D软骨置于诱导培养基中培养。

【技术特征摘要】
1.一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，其特征在于：包括以下步骤：PEG与甲基丙烯酰氯过夜反应制备PEGDMA并纯化；采用全骨髓贴壁法分离人间充质干细胞；将生长状态良好的人间充质干细胞传代并调整密度，待细胞贴壁后更换诱导培养基培养；清洗新鲜牛股骨，在骨软骨栓塞的中心位置用无菌活体穿孔器做出全层软骨缺损，将骨软骨栓塞置于DMEM中培养成3D生物纸；将纯化的PEGDMA溶解，加入光引发剂2959，将步骤ｃ）诱导所得软骨细胞重悬在过滤除菌的PEGDMA溶液中制成生物墨水；将生物打印机消毒灭菌后加入生物墨水，按照设计的形状和大小在3D生物纸上层层打印出3D软骨，将3D软骨置于诱导培养基中培养。2.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，其特征在于：步骤ａ）中采用3kDa的PEG与甲基丙烯酰氯在氮气条件下过夜反应，再通过乙醚析出和过夜冻干的方法进行纯化，使合成的PEGDMA大分子单体纯度大于95%。3.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，其特征在于：步骤ｂ）中分离人间充质干细胞包括在无菌条件下取健康成人骨髓液，用PBS漂洗并计数，将处理后的细胞培养在含20%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素的α-MEM基础培养基中，置于37℃、5%(v/v)CO2的细胞培养箱培养，48小时后换液，之后每隔3天换液。4.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，其特征在于：步骤ｃ）中人间充质干...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔晓峰，高桂芳，
申请(专利权)人：武汉枫霖科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42