本发明专利技术公开了一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用，通过紫外诱变和逐级提高PH驯化筛选的方法获得耐受高PH的凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3，其分类命名为Parachlorella kessleri，已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9238。本发明专利技术选育的凯氏拟小球藻FSH-Y3在高PH值下能够更好的吸收利用二氧化碳，快速生长繁殖，解决了现有凯氏拟小球藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程领域，具体涉及一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用。
技术介绍
随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO2的急剧增加引起的温室效应越来越严重，微藻的生长周期短、光合效率高，CO2固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10倍以上，不仅可以减少CO2排放，同时也降低了培养成本；除CO2外，废气中的一些SOx、NOx等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN20120154470.4公开了一株富油海洋微藻微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)藻株及其应用，该藻株可在pH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%。CN20111019480.X公开了一株微藻藻株（Mychonasessp.）及其用于生产生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸C18:3和神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。CN102703326A公开了一种高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法，但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。上述专利要么不能高效利用CO2生产油脂，要么获得的生物质中油脂含量不够高。特别是在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固碳效率低；同时一般微藻在中性条件下适宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微藻的生长，而微藻利用CO2一般是以溶解在水中的HCO3-离子形式存在的，二氧化碳在中性环境下溶解度低，不利于藻类吸收利用。拟小球藻属是由Krienitz,etal.提出的一个新的属，他通过对小球藻属的凯氏小球藻科核糖体小亚基团（SSUrDNA）进行系统学分析，提出将小球藻属中的凯氏小球藻（C.kessleri）划分到小球藻属，改名为凯氏拟小球藻，与拟小球藻（P.beijerinckii）、胡斯拟小球藻（P.hussii）共同构成了一个新属拟小球藻属。拟小球藻属与小球藻属之间的形态极为相似，仅在细胞壁的超微结构方面有细微差异，与小球藻属相比，凯氏拟小球藻细胞壁的电子透明度较低。但在18SrDNA及ITS序列上差异明显。目前国内外关于凯氏拟小球藻的报道比较少，江丽丽等人在（一株产油微藻的筛选及分子鉴定，水生生物学报，2013年第4期606-612页）报道一株产油微藻HY-6，为球状单细胞，具有1个明显的蛋白核，杯状色素体周生，从而初步判断该藻株可能属于小球藻属（Chlorella）或拟小球藻属（Parachlorella）；18SrDNA及ITS系统学分析表明HY-6与小球藻属分为两个不同的进化支，但与凯氏拟小球藻（Parachlorellakessleri）的亲缘关系较近，且具有较高的自展支持率，因此将其鉴定为凯氏拟小球藻（P.kessleri），总脂单位体积产率最高达50.8mg/(L.d)，是一株具有潜力的产油微藻。但是，该凯氏拟小球藻只适合在中性PH下生长，并未涉及该凯氏小球藻耐受高PH的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用。本专利技术选育的凯氏拟小球藻在高PH值下能够更好的吸收利用二氧化碳，快速生长繁殖，解决了现有凯氏拟小球藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。本专利技术耐受高PH的凯氏拟小球藻，为凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3，其分类命名为Parachlorellakessleri，已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9238。本专利技术提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3在显微镜下藻细胞为球形、椭圆形，内有一个周生、杯状或片状的色素体；无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。本专利技术提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3可以耐受的PH值为10～12，在此PH值条件下的生长速率比原始凯氏拟小球藻快2～5倍。本专利技术提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3藻株的18SrDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本专利技术FSH-Y3藻株与已公布的拟小球藻藻株的18SrDNA数据存在差异。本专利技术提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3，在高PH生长时能增加二氧化碳的溶解度，增加拟小球藻光合作用中对二氧化碳的固定，对二氧化碳的减排有显著作用。凯氏拟小球藻的生长需要吸收二氧化碳，一般来说，二氧化碳的溶解性与溶液的酸碱性有一定的关系，二氧化碳在碱性溶液中溶解度显著升高。因此，所获得凯氏拟小球藻FSH-Y3可耐受高PH值的环境，而在高PH值环境下可以溶解更多的二氧化碳，提高了藻株对二氧化碳的固定效率，对控制二氧化碳污染的温室效应具有重要意义。本专利技术耐受高PH的凯氏拟小球藻的选育方法，包括以下内容：（1）配制凯氏拟小球藻生长的BG11培养基；（2）接种原始凯氏拟小球藻，经光照和黑暗周期诱导，对原始凯氏拟小球藻进行活化；（3）取对数生长期的凯氏拟小球藻进行紫外诱变，然后进行暗培养；（4）将暗培养后的藻液用新鲜培养液稀释后涂布到固体培养基上进行光照培养；（5）挑取生长迅速的单藻落接种到BG11培养液中进行初筛，培养液的PH为8.0～9.0；（6）将步骤（5）初筛的藻液，接种到逐级提高PH的培养液中进行驯化培养，每次PH提高0.5～1.0，筛选获得耐受高PH的藻株。在步骤（1）中，将配制好的BG11培养基分装在50～250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为20～100mL，用透气膜封口，包上牛皮纸。将上述培养基进行灭菌，在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20～30分钟。在步骤（2）中，按接种液与培养液的体积比为1:10～1:5接种，操作在无菌间进行，接种后将培养液摇匀，用透气膜包好。所述的光照和黑暗周期诱导是在22～32℃的恒温光照反应摇床中进行，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10；摇床转速为80～160rpm，培养4～7天，获得活化的原始凯氏拟小球藻藻液。在步骤（3）中，取对数生长期的藻液5～10mL置于无菌培养皿中进行紫外诱变，藻液在培养皿底面铺一薄层，培养皿放在无菌的暗室中，打开皿盖。在磁力搅拌下，用30w的紫外灯照射诱变，照射时间为10～20min，紫外灯与培养皿的距离为15～25cm，照射致死率为60%～80%。照射后盖上皿盖，用不透光的纸包好培养皿进行暗培养，暗反应的培养温度为20～30℃，培养时间为24～72h。在步骤（4）中，将步骤（3）暗反应后的藻液用BG11新鲜培养基稀释10～10000倍，吸取0.1～0.3mL涂布到BG11固体琼脂平板（琼脂含量为1%～2%）上。在光照培养箱中进行培养，培养温度为20～30℃，光照强度为1000～5000Lux，光暗反应周期为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐受高PH的凯氏拟小球藻，为凯氏拟小球藻突变株FSH‑Y3，其分类命名为Parachlorella kessleri，已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9238。
【技术特征摘要】
1.一种耐受高PH的凯氏拟小球藻，为凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3，其分类命名为Parachlorellakessleri，已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9238。2.按照权利要求1所述的凯氏拟小球藻，其特征在于：该藻株在显微镜下藻细胞为球形、椭圆形，内有一个周生、杯状或片状的色素体；无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。3.按照权利要求1所述的凯氏拟小球藻，其特征在于：该藻株可以耐受的PH值为10～12，在此PH值条件下的生长速率比原始凯氏拟小球藻快2～5倍。4.权利要求1至3任一权利要求所述的耐受高PH的凯氏拟小球藻的选育方法，其特征在于包括以下内容：（1）配制凯氏拟小球藻生长的BG11培养基；（2）接种原始凯氏拟小球藻，经光照和黑暗周期诱导，对原始凯氏拟小球藻进行活化；（3）取对数生长期的凯氏拟小球藻进行紫外诱变，然后进行暗培养；（4）将暗培养后的藻液用新鲜培养液稀释后涂布到固体培养基上进行光照培养；（5）挑取生长迅速的单藻落接种到BG11培养液中进行初筛，培养液的PH为8.0～9.0；（6）将步骤（5）初筛的藻液，接种到逐级提高PH的培养液中进行驯化培养，每次PH提高0.5～1.0，筛选获得耐受高PH的藻...
【专利技术属性】
技术研发人员：师文静，廖莎，孙启梅，王鹏翔，李晓姝，樊亚超，张霖，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。