单链TRAIL受体激动剂蛋白制造技术

本文提供了特定的TRAIL受体激动剂蛋白、其编码核酸、以及治疗患有TRAIL相关疾病或障碍的个体的方法。本文提供的TRAIL受体激动剂蛋白包含三个可溶性TRAIL域和一个Fc片段。所述TRAIL受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适合治疗、诊断和/或研究应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关专利申请本申请要求于2014年4月23日提交的美国临时专利申请号61/983,152的优先权权益，其以引用方式全文并入本文。专利
本专利技术提供了包含三个可溶性TRAIL域和一个Fc片段的特定的TRAIL受体激动剂蛋白、编码所述TRAIL受体激动剂蛋白的核酸分子及其用途。所述TRAIL受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适合治疗、诊断和/或研究应用。专利技术背景众所周知，TNF超家族(TNFSF)细胞因子的三聚化是有效的受体结合和活化所必需的。然而，难以从重组单体单元制备TNF超家族细胞因子的三聚体复合物。WO01/49866和WO02/09055公开了重组融合蛋白，其包含TNF细胞因子和多聚化组分，特别是C1q蛋白质家族的蛋白质或胶原凝集素。然而，这些融合蛋白的缺点在于：三聚化域通常具有大的分子量并且/或者三聚化的效率很低。Schneider等人(JExpMed187(1989),1205-1213)描述了通过位于N-末端的稳定基序来稳定TNF细胞因子的三聚体。在CD95L中，受体结合域三聚体的稳定据推测是由位于细胞质膜附近的N-末端氨基酸域造成的。Shiraishi等人(BiochemBiophysResCommun322(2004),197-202)描述了CD95L的受体结合域可由位于N-末端的人工α-螺旋卷曲螺旋(亮氨酸拉链)基序稳定。然而，据发现，几乎无法预测多肽链彼此间的取向，例如平行或反平行取向。另外，难以确定卷曲螺旋拉链基序中七残基重复序列的最佳数量。另外，卷曲螺旋结构倾向于在pH和/或离子强度改变后形成大分子聚集体。WO01/25277涉及单链低聚多肽，其结合细胞受体的细胞外配体结合域，其中所述多肽包含至少三个受体结合位点，其中至少一个能够结合所述细胞受体的配体结合域并且至少一个不能有效结合所述细胞受体的配体结合域，从而所述单链低聚多肽能够结合所述受体但不能活化所述受体。例如，所述单体来源于TNF家族的细胞因子配体，特别是来自TNF-α。WO2005/103077公开了单链融合多肽，其包含TNF家族配体成员的至少三个单体和将所述TNF配体家族成员的单体彼此连接的至少两个肽接头。然而，最近的实验表明，这些单链融合多肽显示出不期望的聚集。WO2010/010051公开了单链融合多肽，其包含三个可溶性TNF家族细胞因子域和至少两个肽接头。所述融合多肽基本上是非聚集的。此外，此前的研究，包括Papadopoulos等人(CancerChemotherPharmacol,2015,DOI10.1007/s00280-015-2712-0)在内，已经证实，TRAIL受体的超集群可以导致毒性。因此，本领域需要新型的TRAIL受体激动剂，其具有高生物活性、高稳定性、低毒性并且允许有效的重组生产。专利技术概述本专利技术提供了特定的TRAIL受体激动剂蛋白，其在体内具有低蛋白水解降解、长半衰期和低TRAIL受体超集群（连同随之而来的毒性）。本专利技术的TRAIL受体激动剂蛋白通常包含：(i)第一可溶性TRAIL细胞因子域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性TRAIL域；(iv)第二肽接头；(v)第三可溶性TRAIL域；和(vi)抗体Fc片段。在一个方面，本专利技术提供了单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性TRAIL域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性TRAIL域，(iv)第二肽接头，(v)第三可溶性TRAIL域，和(vi)抗体Fc片段。在一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)位于所述第一TRAIL域(i)的N-末端以及/或者所述第三TRAIL域(v)的C-末端。在另一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)位于所述第三TRAIL域(v)的C-末端。在一个实施方案中，所述多肽基本上是非聚集的。在另一个实施方案中，所述第二和/或第三可溶性TRAIL域是任选地包含氨基酸序列突变的N-末端缩短的域。在一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域中的至少一个，特别是所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)中的至少一个，是具有N-末端序列的可溶性TRAIL域，所述序列起始于人类TRAIL的氨基酸Gln120至Val122之间，并且其中Arg121可被中性氨基酸（例如，Ser或GIy）替换。在另一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域中的至少一个，特别是所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)中的至少一个，是具有N-末端序列的可溶性TRAIL域，所述序列选自(a)Arg121–Val122–Ala123和(b)(Gly/Ser)121–Val122–Ala123。在一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域终止于人类TRAIL的氨基酸Gly281，并且/或者任选地在以下位置包含突变：R130、G160、H168、R170、H177、Y189、R191、Q193、E195、N199、K201、Y213、T214、S215、H264、I266、D267或D269或所述位置中的两处或更多处。在一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域(i)由根据SEQIDNO:1的人类TRAIL的氨基酸Gln120–Gly281组成，而所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)由根据SEQIDNO:1的人类TRAIL的氨基酸Arg121–Gly281组成。在一个实施方案中，所述第一和第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选地为甘氨酸/丝氨酸接头，任选地包含可被糖基化的天冬酰胺残基。在一个实施方案中，所述第一和第二肽接头(ii)和(iv)由根据SEQIDNO:2的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，所述多肽另外包含例如SEQIDNO:12的N-末端信号肽域（其可包含蛋白酶裂解位点），并且/或者其另外包含C-末端元件（其可包含识别/纯化域（例如，根据SEQIDNO:13的Strep-标签）并且/或者与之相连）。在一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)通过优选地SEQIDNO:11的铰链接头被融合至所述可溶性TRAIL域(i)和/或(v)。在另一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)由如SEQIDNO:10或17中所示的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:14、15或18的氨基酸序列。在另一方面，本专利技术提供了包含多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述多肽含有SEQIDNO:19、20或21中所示的氨基酸序列。在另一方面，本专利技术提供了包含多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述多肽含有SEQIDNO:26、27、28、29或30中所示的氨基酸序列。在另一方面，本专利技术提供了包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述两条多肽含有SEQIDNO:19中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两条多肽通过形成于各自多肽的半胱氨酸残基513、519和522之间的三个链间二硫键共价连接。在一个实施方案中，所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基中的一个或多个是N-糖基化的。在另一个实施方案中，所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基均是N-糖基化的。在另一个实施方案中，所述多肽还经过了翻译后修饰。在另一个实施方案中，所述翻译本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述多肽具有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.23 US 61/9831521.包含多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述多肽具有SEQIDNO:19中所示的氨基酸序列。2.包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述两条多肽具有SEQIDNO:19中所示的氨基酸序列。3.权利要求2的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述两条多肽通过形成于各自多肽的半胱氨酸残基513、519和522之间的三个链间二硫键共价连接。4.权利要求1、2或3的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基中的一个或多个是N-糖基化的。5.权利要求1、2或3的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基均是N-糖基化的。6.权利要求1-5的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述多肽还经过翻译后修饰。7.权利要求6的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述翻译后修饰包括将N-末端谷氨酰胺修饰成焦谷氨酸。8.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项的TRAIL受体激动剂蛋白和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐...

【专利技术属性】
技术研发人员：O希尔，C吉菲尔斯，M蒂曼，FG布查南，DC菲利普斯，SE拉普，
申请(专利权)人：艾伯维公司，阿珀吉尼科斯股份公司，
类型：发明
国别省市：美国;US