本发明专利技术公开了一种产类阿片样活性小肽的胶红酵母、其筛选方法及其应用，该胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的保藏编号是：CGMCC No.10969。该菌株用作畜禽饲料添加剂，可增强动物的抗病力，降低发病率和死淘率，分离纯化方法是将杏仁放于霉菌生长的环境中，待产生少量霉菌时，分别于杏仁的外表面、中间和内部取样，混合研磨成粉，加水混匀，取其上清液梯度稀释，取稀释液于YEPD培养基培养出酵母菌，再划线接种于相同培养基得单菌落，易于操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酵母菌的分离筛选、鉴定及其应用，具体地说是涉及一种能产生类阿片样生物活性小肽的胶红酵母XR-1CGMCCNo.10969的分离培养和鉴定，及其作为畜禽饲料添加剂用途。
技术介绍
酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物，可在缺氧环境中生存。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”(类酵母)。红酵母属，属于隐球酵母科，细胞为圆形、卵形或长形，为多边芽殖，多数种类没有假菌丝，其特点是，有明显的红色或黄色色素，很多种因形成荚膜而使菌落呈粘质状，如粘红酵母。红酵母菌没有酒精发酵的能力，少数种类为致病菌，在空气中时常发现。广泛分布于海洋、淡水等环境中，其富蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、消化酶及生长因子等多种营养物质。更为重要的是红酵母能合成生产以虾青素为主的类胡萝卜素，是相当优质的微生物饲料。目前红酵母的应用还不是很普及，但它在许多方面有开发利用的空间。1979年，Zioudrou发现酪蛋白和麦谷蛋白的胃蛋白酶酶解产物具有阿片样活性，由于这些阿片肽均来自外源性食物，其阿片活性同吗啡一样能被纳洛酮(一种阿片拮抗剂)所逆转，所以称为外源性阿片肽，简称外啡肽(exorphine)。目前发现外啡肽具有很广泛的生理功能，主要可以延缓各种动物的胃排空，抑制肠内容物的转移；对内分泌的调节作用，可引起血液中胰岛素的含量显著升高和SS含量显著增加，亦可导致血液中催乳素水平显著升高，另外还可以影响痛觉抑制系统、情感和记忆过程和调节机体的免疫系统功能和促进淋巴细胞增殖。阿片肽作为极有潜力的药物具有高活性，特异性高，毒性低，副作用小等若干优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了克服现有技术的不足，提供一种能产生类阿片样生物活性小肽的胶红酵母，保藏编号为CGMCCNo.10969，保藏日期是2015年6月9日，易于培养，生产安全性高，遗传稳定性好。本专利技术的另一个目的在于提供一种能产生类阿片样生物活性小肽的胶红酵母的筛选方法。本专利技术的再一个目的在于提供一种能产生类阿片样生物活性小肽的胶红酵母作为畜禽饲料添加剂的用途，添加量低、功能明确，能提高动物对营养素(如蛋白质、矿物质、维生素等)吸收利用率、提高奶、肉、蛋的产量和生产能力，改善肉、蛋、奶的品质和风味，刺激动物免疫器官发育、提高抗病力、减少发病率，并能明显改善水产动物养殖水质，提高水产动物生长速度和存活率，广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：产类阿片样活性小肽的胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)，保藏编号为CGMCCNo.10969,保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。产类阿片样活性小肽的胶红酵母的筛选方法，步骤如下：(1)杏仁放于霉菌生长的环境中7～14天，待产生少量霉菌时，于生杏仁的外表面、中间或者内部取样，研磨成粉，取1g加入100mL无菌水，置于摇床上150r/min、30min，静止，取其上清液10倍、100倍、1000倍的梯度稀释，得到稀释液，备用；(2)菌种的分离与纯化：分别取上述三份稀释液0.2mL于YEPD培养基，在28℃划线或涂布培养，2d后从平板上挑取酵母菌，再划线接种于新配置的相同YEPD培养基，相同培养条件下，培养得单菌落；(3)酵母菌种的PCR鉴定：将纯化的酵母菌制成菌悬液，采用特异性上游引物1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’和下游引物：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，常规PCR体系条件反应，将PCR产物进行测序，根据测序结果，在NCBIBLAST系统中进行比对，完成菌种鉴定。(4)胶红酵母的大规模液体培养方法，步骤如下：母菌种→斜面活化菌种→种子的扩大培养、培养基的配制与灭菌→无菌空气的制备→液体发酵→离心→烘干→添加载体预混成品。有益效果：一、类阿片样生物活性小肽的检测1-1、胶红酵母XR-1CGMCCNo.10969产生了具有类阿片样生物活性小肽实验方法(1)将胶红酵母CGMCCNo.10969通过机械破碎法(研磨)，再结合盐酸-热处理结合破碎法获得细胞内容物。然后4000r/min低温离心20min，取上清液于-20℃冰箱保存备用。(2)选用中华大蟾蜍心脏离体建立体外循环系统，方法是，分别从蛙心主动脉和腔静脉插管构成体外循环。心尖端接上一量程为0.1kgf/cm2的张力换能器，连接二道生理记录仪，记录仪的各项参数分别为滤波：100HZ；时间常数：0.2s；灵敏度：0.5～1.0mv/cm；纸速：2.5mm/s。在体外循环液中，取上述步骤中取得酵母菌培养物1ml，室温，10000rpm离心5min，收集菌体，加入酵母裂解液(2％triton100，1％SDS，0.1MNaCl，10mMtris-HClph8，1mMEDTA)和酸洗玻璃珠，剧烈振荡5min，室温，12000rmp，离心5min，取上清液,即为胶红酵母裂解上清液。加入胶红酵母裂解上清液80ul，检测对心肌活动的影响；在此基础上加入阿片肽拮抗剂-纳洛酮80ul，以检测类阿片样生物活性，结果见表1。表1胶红酵母细胞裂解液中类阿片样生物活性小肽的检测说明：*：P＜0.05，n＝6，平均数±标准差。从表1中可以看出：加入胶红酵母细胞裂解液对心肌收缩力产生显著性加强作用，加入纳洛酮后均能显著性减弱心肌收缩力。1-2、心脏体外循环系统检测胶红酵母细胞裂解液类阿片样生物活性小肽效应从图7可见：加入裂解液后心肌收缩力增强，待心脏收缩活动相对稳定，再加入阻断剂-纳洛酮，可见心肌收缩力明显减弱，心率基本没有变化。二、作为畜禽饲料添加剂的用途(1)使用方法：(1)与饲料混合或拌料、直接口服或加入水中饮用；(2)畜禽种类：仔猪、肉仔鸡、母猪、育肥猪、产蛋鸡、肉鸭；(3)用量：106～108(含活性菌有效成分CFU/吨饲料)。(2)猪饲养中的应用选取健康的30日龄断奶仔猪(公母各半)144头，分为4个处理组，每个处理组36头，每个处理组设置6个重复组，每个重复组6头猪，均为3公3母，试验期8周，实验设计见表2，试验结果列于表3。表2.仔猪试验设计组别处理组(含活性菌有效成分CFU/吨饲料)试验1组106试验2组107试验3组108对照组空白对照表3.在养猪生产中的使用效果组别30～90日龄平均日增重30～90日龄料重比试验1组0.396±0.011.86±0.07试验2组0.468±0.03*1.68±0.05*试验3组0.385±0.021.79±0.08对照组0.270±0.032.34±0.08注：*，p<0.05从表3中可以看出，添加了胶红酵母菌的3个不同剂量组的平均日增重和饲料转化效率均优于空白对照组，可明显提高猪的生产性能，即日增重和饲料转化效率。(3)对肉仔鸡生产性能(增重速度和耗料)影响实验为检测本专利技术的活菌制剂对肉鸡生产性能的影响，将肉仔鸡分为4组本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产类阿片样活性小肽的胶红酵母，其特征在于保藏编号为 CGMCC No.10969。
【技术特征摘要】
1.一种产类阿片样活性小肽的胶红酵母，其特征在于保藏编号为CGMCCNo.10969。2.权利要求1所述的产类阿片样活性小肽的胶红酵母的筛选方法，其特征在于：（1）生杏仁放于霉菌生长的环境中，待产生少量霉菌时，取样，研磨成粉，取1g加入100mL无菌水，置于摇床上150r/min、30min，取其上清液10倍、100倍、1000倍的梯度稀释，得到稀释液，备用；（2）菌种的分离与纯化：分别取上述三份稀释液0.2mL于YEPD培养基，在28℃划线或涂布培养，2d后从平板上挑取酵母菌，再划线接种于新配置的相同YEPD培养基，相同培养条件下，培养得单菌落；（3）酵母菌种的PCR鉴定：将纯化的酵母菌制成菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：周业飞，周梅仙，毛善国，扶庆权，王真祯，高一心，
申请(专利权)人：南京晓庄学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。