分析禾本科植物遗传多样性的PCR引物、方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种分析禾本科植物遗传多样性的PCR引物、方法及试剂盒。本发明专利技术提供的技术方案通过在13份DNA中挑选取3个性状各异的DNA模板，用SRAP标记技术从100对引物中筛选出有清晰多态性条带的21对引物，用筛选出来的21对引物对13份DNA进行标记，并电泳、成像、拍照、统计数据，使用ntsys软件完成对各种的遗传，似性和遗传距离进行UPGMA法聚类分析图，进行多样性分析和种间关系研究。研究表明：禾本科植物种质资源间存在着丰富的遗传多样性；这些材料的遗传类群与地理来源和地理环境没有较大关系；SRAP分子标记是一种适合用于禾本科植物种质资源研究的分子标记。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种分析禾本科植物遗传多样性的PCR引物、方法及试剂盒。
技术介绍
遗传多样性是每种生物固有的特性,是长期适应和进化的产物。钝叶草的遗传多样性就其本身而言,是非常重要的。当某一物种的基因多样性消失后，就不会再恢复了，而当基因多样性降低至一定程度后，会发生近交衰退甚至导致物种灭绝。我国是钝叶草属植物的原产地之一，分布范围也很广，目前已经有学者研究过钝叶草，如黄娟、老猫等。但深入到分子层面的研究依然少有见闻。基于PCR的新型分子标记技术一SRAP(Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism)标记的专利技术和应用弥补了以上分子标记的不足且具备了它们的优点。此技术是由美国加里弗尼亚大学，蔬菜系Li和Quiros于2001年在芸薹属植物中开发提出的。SRAP标记是根据基因外显子中丰富的GC含量和内含子、启动子中丰富的TA含量的特点，利用独特的引物设计对ORFs(Openreadingframes,开放阅读框架)进行扩增，因不同个体间的外显子、内含子和启动子的不同而产生多态性。SRAP标记简单、稳定可靠、重复性好、多态性高、在基因组中分布均匀、引物非特异性、少量引物可组配多种引物对等优点使其在多种植物中得到广泛的应用。引物大小和引物组合是成功进行SRAP分析的关键。目前，还未有报道用于钝叶草种质资源研究的SRAP分子标记引物。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物组、方法及试剂盒。本专利技术提供的分析禾本科植物遗传多样性的分子鉴定方法，可对分析禾本科植物遗传多样性进行SRAP分子标记鉴定，快速、准确。第一方面，本专利技术提供了一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物，包括如下a)-v)引物对的至少一对：a).引物对E1M2、b).引物对E1M10、c).引物对E2M2、d).引物对E3M4、e).引物对E4M7、f).引物对E5M3、g).引物对E5M6、h).引物对E6M3、i).引物对E7M3、j).引物对E7M4、k).引物对E8M1、m).引物对E8M4、n).引物对E8M8、o).引物对E9M2、p).引物对E9M3、q).引物对E9M6、r).引物对E10M3、s).引物对E10M4、t).引物对E10M5、u).引物对E10M6、v).引物对E10M9；其中，M1-M10正向引物的核苷酸序列(3'-5')为：M1TGAGTCCAAACCGGATAM2TGAGTCCAAACCGGAGCM3TGAGTCCAAACCGGAATM5TGAGTCCAAACCGGAAGM6TGAGTCCAAACCGGAGCM7TGAGTCCAAACCGGTAGM8TGAGTCCAAACCGGTAAM9TGAGTCCAAACCGGTCCM10TGAGTCCAAACCGGTGC；其中，E1-E10反向引物的核苷酸序列(3'-5')为：E1GACTGCGTACGAATTAATE3GACTGCGTACGAATTGACE4GACTGCGTACGAATTTGAE5GACTGCGTACGAATTAAC。E6GACTGCGTACGAATTGCAE7GACTGCGTACGAATTCGAE8GACTGCGTACGAATTCAAE9GACTGCGTACGAATTCTGE10GACTGCGTACGAATTAGC。在本专利技术一实施例中，禾本科植物为钝叶草或结缕草。在本专利技术一实施例中，采用鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物所获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传距离为0.54～0.92。在本专利技术一实施例中，采用鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物所获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传多态性带数总和不低于154个。在本专利技术一实施例中，所述的SRAP分子标记引物为E9M3、E1M10两对引物对；E9M3、E10M3两对引物对或E9M3、E6M33两对引物对组成的PCR引物组。在本专利技术一实施例中，所述的SRAP分子标记引物为E9M3、E9M2、E1M10组成的PCR引物组。第二方面，本专利技术还提供了一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记方法，为用如第一方面所述引物对待鉴定的禾本科植物的基因组DNA进行PCR扩增；扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测、测序；获得SRAP条带；再对所得SRAP条带进行遗传多样性分析，获得分析禾本科植物遗传多样性信息。在本专利技术一实施例中，禾本科植物为钝叶草或结缕草。在本专利技术一实施例中，所述PCR体系中，DNA模板用量为50-200ng、Mg2+浓度为2.6mmol/L、引物总浓度为10μmol/L(上游、下游引物各0.5μmol/L)、dNTP浓度为0.22mmol/L、Taq酶用量为1U。优选地，多重PCR扩增反应条件为：在本专利技术一实施例中，所述对所得SRAP条带进行遗传多样性分析的步骤具体包括：以1和0记录等位基因的有和无，获得矩阵；用ntsys分析软件，计算多态位带数、多态带数百分率、观测等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数中的一种或多种；对带鉴定禾本科植物中的遗传相似性和遗传距离进行UPGMA法聚类分析，获得分析禾本科植物遗传多样性信息。在本专利技术一实施例中，所述获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传距离为0.54～0.92。在本专利技术一实施例中，所述获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传多态性带数总和不低于154个。第三方面，本专利技术还提供了一种分析禾本科植物遗传多样性的试剂盒，包括如第一方面所述的鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物，还包括用于PCR的缓冲液、DNA聚合酶。第四方面，本专利技术还提供了一种如第一方面所述的SRAP分子标记引物在鉴定分析禾本科植物遗传多样性中的应用。本专利技术的有益效果在于：通过本专利技术提供的技术方案可得到清晰的用于多样性分析的谱带，在本专利技术一实施例中，得到了多态性条带共154条，多态性比率为81.48％；这一方面说明了钝叶草属植物同种质资源间存在着丰富的遗传变异，检测方法对于能否检测到尽可能多的遗传变异很关键。同时也说明了本专利技术提供的技术方案在钝叶草等草类植物遗传多样性研究中较高的检出效率。具体地，在本专利技术实施例中，本专利技术提供了一组SRAP-PCR标记引物组，通过聚类分析把13份不同地方采集的钝叶草属种源的DNA划分为4个类群，可以看出其中科特迪瓦的两种钝叶草优先聚集并和马尔代夫、斯里兰卡、澳大利亚和哥斯达黎加的DNA材料聚为一个类群；甘肃兰州的金心钝叶草(2)、海南琼中钝叶草和海南耐盐钝叶草聚集为一个类群；委内瑞拉钝叶草和海南本地钝叶草聚为一个类群；甘肃兰州金心钝叶草(1)和海南琼中钝叶草聚为一个类群。分析结果表明，同种之间存在遗传分化。本专利技术实施例通过SRAP分子标记技术对钝叶草属植物的遗传多样性进行研究，结果显示2、5、12聚为一类，10和13聚为一类等，表示其亲缘关系较近，SRAP分子标记聚类分析给草种确定身份提供了新的信息，这些都体现出SRAP分子标记技术在钝叶草属植物遗传多样性研究中的优越性和有效性，本专利技术的结论为SRAP分子标记技术在禾本科植物进一步研究中的应用奠定了良好的基础。附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物，其特征在于，包括如下a)‑v)引物对的至少一对：a).引物对E1M2、b).引物对E1M10、c).引物对E2M2、d).引物对E3M4、e).引物对E4M7、f).引物对E5M3、g).引物对E5M6、h).引物对E6M3、i).引物对E7M3、j).引物对E7M4、k).引物对E8M1、m).引物对E8M4、n).引物对E8M8、o).引物对E9M2、p).引物对E9M3、q).引物对E9M6、r).引物对E10M3、s).引物对E10M4、t).引物对E10M5、u).引物对E10M6、v).引物对E10M9；其中，M1‑M10正向引物的核苷酸序列(3'‑5')为：M1 TGAGTCCAAACCGGATAM2 TGAGTCCAAACCGGAGCM3 TGAGTCCAAACCGGAATM5 TGAGTCCAAACCGGAAGM6 TGAGTCCAAACCGGAGCM7 TGAGTCCAAACCGGTAGM8 TGAGTCCAAACCGGTAAM9 TGAGTCCAAACCGGTCCM10 TGAGTCCAAACCGGTGC；其中，E1‑E10反向引物的核苷酸序列(3'‑5')为：E1 GACTGCGTACGAATTAATE3 GACTGCGTACGAATTGACE4 GACTGCGTACGAATTTGAE5 GACTGCGTACGAATTAACE6 GACTGCGTACGAATTGCAE7 GACTGCGTACGAATTCGAE8 GACTGCGTACGAATTCAAE9 GACTGCGTACGAATTCTGE10 GACTGCGTACGAATTAGC。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物，其特征在于，包括如下a)-v)引物对的至少一对：a).引物对E1M2、b).引物对E1M10、c).引物对E2M2、d).引物对E3M4、e).引物对E4M7、f).引物对E5M3、g).引物对E5M6、h).引物对E6M3、i).引物对E7M3、j).引物对E7M4、k).引物对E8M1、m).引物对E8M4、n).引物对E8M8、o).引物对E9M2、p).引物对E9M3、q).引物对E9M6、r).引物对E10M3、s).引物对E10M4、t).引物对E10M5、u).引物对E10M6、v).引物对E10M9；其中，M1-M10正向引物的核苷酸序列(3'-5')为：M1TGAGTCCAAACCGGATAM2TGAGTCCAAACCGGAGCM3TGAGTCCAAACCGGAATM5TGAGTCCAAACCGGAAGM6TGAGTCCAAACCGGAGCM7TGAGTCCAAACCGGTAGM8TGAGTCCAAACCGGTAAM9TGAGTCCAAACCGGTCCM10TGAGTCCAAACCGGTGC；其中，E1-E10反向引物的核苷酸序列(3'-5')为：E1GACTGCGTACGAATTAATE3GACTGCGTACGAATTGACE4GACTGCGTACGAATTTGAE5GACTGCGTACGAATTAACE6GACTGCGTACGAATTGCAE7GACTGCGTACGAATTCGAE8GACTGCGTACGAATTCAAE9GACTGCGTACGAATTCTGE10GACTGCGTACGAATTAGC。2.如权利要求1所述的鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物，其特征在于，所述的SRAP分子标记引物为E9M3、E1M10两对引物对；E9M3、E10M3两对引物对或E9M3、E6M33两对引物对组成的PCR引物组。3.权利要求1所述的鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄春琼，刘国道，白昌军，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46