一氧化碳释放分子‑2 制剂及其在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用和检测方法技术

本发明专利技术公开了一氧化碳释放分子‑2制剂及其在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用和检测方法，属于医药技术领域。CORM‑2(Tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer)中文名称是一氧化碳释放分子‑2，本发明专利技术通过体外实验证明一氧化碳释放分子‑2具有明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的作用，为通过药物治疗增强对猪繁殖与呼吸综合征病毒防控提供有力支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗病毒研究
，具体涉及一氧化碳释放分子-2制剂及其在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用和检测方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinerepsoductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)，又称猪蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerepsoductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的，能引起妊娠母猪繁殖障碍(后期出现流产、弱胎、死胎、木乃伊胎等)及各年龄段猪特别是仔猪呼吸道症状(间质性肺炎)和高死亡率为主要特征的猪重要传染病，因此对养猪业危害极大。猪繁殖与呼吸综合征对整个养猪行业构成严重威胁，由于人们对该病免疫逃逸的分子机制缺乏了解，目前疫苗的使用也不能提供有效且可持续的疾病控制，特备是对那些RNA类病毒更是无能为力；同时基于对健康安全食品的关注和需求，动物抗生素的使用已引起越来越多消费者的反对。因此，开发有效的抗病毒药物及制定新型抗病毒策略仍然极为重要和迫切。CORM-2(Tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer)，中文名称是一氧化碳释放分子-2，其结构式如式I所示：
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一氧化碳释放分子-2制剂，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本专利技术的另一个目的是提供一氧化碳释放分子-2制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用。本专利技术的另一个目的是提供一氧化碳释放分子-2制剂的检测方法。本专利技术通过体外实验发现CORM-2具有明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的作用，为通过药物治疗增强对猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控提供有力支持。因此，本专利技术提供一种CORM-2在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用，同时本专利技术提供一种CORM-2在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制制剂。本专利技术所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：本专利技术通过体外实验发现CORM-2具有明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的作用，为通过药物治疗增强对猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控提供有力支持。因此，本专利技术提供一种CORM-2在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物上的应用，同时本专利技术提供一种CORM-2在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制制剂中的应用。一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制剂，包括有效量的CORM-2和药学上可接受的辅料。优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。更优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂；所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。本专利技术首先采用qPCR、westernblot、TCID50和间接免疫荧光技术检测CORM-2这种药物对猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中复制的影响。然后再通过qPCR，westernblot和TCID50检测CORM-2对猪繁殖与呼吸综合征病毒在PAM细胞复制的影响，在上述结果的基础上对COMR-2的抗病毒效果进行评价。本专利技术的有益效果：1、本专利技术的CORM-2生产工艺成熟，可以为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制备提供充足的原料。2、本专利技术的CORM-2抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果明显，本专利技术通过体外实验发现，CORM-2能显著抑制PRRSV在Marc-145细胞和PAM细胞中复制与增殖。3、本专利技术使用方便，药品为粉末制剂，2-8℃密封保存即可保存，易于运输，且即溶即用。附图说明图1是qPCR检测不同浓度CORM-2处理后PRRSVORF7mRNA表达。图2是westernblot检测不同浓度CORM-2处理对PRRSV感染Marc-145细胞的影响。图3是不同浓度CORM-2处理后Marc-145细胞培养上清PRRSVTCID50的测定。图4间接免疫荧光检测不同浓度CORM-2处理对PRRSVN蛋白表达的影响。图4为合并红光和蓝光的结果，其中，中间的蓝色部分为细胞核部分，由DAPI染色；左侧的红色荧光为标记了TRITC的病毒N蛋白。图5是qPCR检测不同浓度CORM-2处理后PAM细胞中PRRSVORF7mRNA表达。图6是westernblot检测不同浓度CORM-2处理对PRRSV感染PAM细胞的影响。图7是不同浓度CORM-2处理后PAM细胞培养上清PRRSVTCID50的测定。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。本专利技术实施例中选用Marc-145细胞(恒河猴肾细胞MA-104的衍生细胞系)作为PRRSV高致病毒株GD-HD的营养基质，为PRRSV繁殖提供营养，因此选用Marc-145细胞不对本专利技术的范围做任何限定。实施例中所用材料来源：CORM-2购自Sigma公司；DMEM，RPMI1640、胎牛血清(FBS)购自Gibco；GD-HD-PRRSV由西北农林科技大学动物医学院兽医免疫生物学课题组分离；FastStartUniversalSYBRGreenMaster购自Roche公司；PrimescriptRTreagentKit购自大连宝生；灭活CORM-2(iCORM-2)的制备如下所述：CORM-2溶于DMSO后，在37℃，5％CO2的潮湿条件下孵育24h，以充分释放一氧化碳。Marc-145细胞(恒河猴肾细胞MA-104的衍生细胞系)登载于中国典型培养物保藏中心(保藏编号GDC041)的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。猪肺泡巨噬细胞(PAM)来源详见下文所述。针对PRRSVN蛋白的特异性单克隆抗体由西北农林科技大学动物医学院兽医免疫生物学课题组制备。实施例1qPCR检测细胞内PRRSVORF7基因mRNA相对表达量样品的收集PRRSV接种80％汇合度的Marc-145细胞，37℃孵育1h，吸弃病毒液，细胞用1×PBS洗3次，分别加入含有不同浓度的CORM-2(50μM、100μM、150μM)以及3％胎牛血清的DMEM维持液培养基于37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养；同时用不含CORM-2的3％胎牛血清的DMEM维持液培养基及加入含150μMiCORM-2的维持液培养基作为对照，24hpi收集细胞及上清。细胞样品总RNA提取(1)每107个/细胞加入1mlTrizol，吹打混匀至无肉眼可见沉淀，室温静止5min。(2)向上述匀浆裂解液中加入氯仿(1/5Trizol的体积量)，盖紧离心管盖，用涡旋振荡仪振荡15s。待溶液充分乳化(无明显分层现象)后，再室温静置5min。(3)12000g，4℃离心5min。(4)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆分为三层，无色的上清、中间白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。小心吸取上清转移至另一新的离心管中(切记勿吸出白色中间层)。(5)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min。(6)12000g4℃离心10min；离心后，试管底部出现白色沉淀。(7)RNA沉淀的清洗：小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％乙醇1ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，12000g4℃离心5min，小心弃去乙醇，应尽量使乙醇挥发干净。(8)RNA溶解：室温干本文档来自技高网...

【技术保护点】
一氧化碳释放分子‑2制剂，其特征在于，包括一氧化碳释放分子‑2和辅料，所述一氧化碳释放分子‑2英文名称是CORM‑2(Tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer)，其结构式如式I所示，所述一氧化碳释放分子‑2的剂量为50‑150μM/L，所述辅料为DMSO。

【技术特征摘要】
1.一氧化碳释放分子-2制剂，其特征在于，包括一氧化碳释放分子-2和辅料，所述一氧化碳释放分子-2英文名称是CORM-2(Tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer)，其结构式如式I所示，所述一氧化碳释放分子-2的剂量为50-150μM/L，所述辅料为DMSO。2.根据权利要求1所述的一氧化碳释放分子-2制剂，其特征在于：所述药物制剂为注射剂或...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖书奇，周恩民，张昂克，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61