一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途。该试剂盒是根据猪流感病毒M基因而研制的实时荧光RT‑PCR试剂盒，包括针对猪流感病毒M基因序列设计的Taqman荧光探针及引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的试剂盒能够特异性地检测仔猪脐带血中的猪流感病毒，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。并且本发明专利技术的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物病原分子诊断
，特别涉及一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途。
技术介绍
猪流感(Swineinfluenza，SI)是由猪流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)引起的猪的一种急性、热性和高度接触性呼吸道疾病，多呈流行性发生，临床上以突发高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭甚至死亡为特征。一般是突然发病，很快感染全群，各个年龄、性别、品种的猪都易感，但很少导致猪的死亡。目前，欧、美、亚、非等世界各大洲均有本病的发生。SI是一种世界性的猪呼吸道传染病，也是主要的猪免疫抑制病之一，在规模化养猪场中普遍存在，难以根除。由于SIV可损害呼吸道上皮细胞，容易继发或混合感染猪繁殖与呼吸综合征、副猪嗜血杆菌病、猪巴氏杆菌病、猪链球菌等呼吸系统疾病，导致病情变得复杂，死亡率增高，给养猪业带来更大的危害。尽管目前尚未在猪群内检测到该流感病毒的流行，但猪是人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的共同宿主，在流感病毒跨种传播的过程中，可能在猪体内发生基因重排，产生新的病毒株，造成新的流行。此外，人也可以感染猪流感病毒，因此快速准确的诊断和监测猪流感，具有重要的经济学意义和公共卫生学意义。猪流感病毒属于正黏病毒科，A型流感病毒属，为单股负链RNA病毒，能引起各种动物以及人类感染甚至死亡，不仅给养殖业造成了巨大的经济损失，而且对人类健康也造成了严重的威胁。其基因组由PB2、PB1、PA、HA、NP、HA、NA、M、NS8个片段组成，共编码11种蛋白质。A型流感病毒(InfluenzavirusA)为单股负链RNA病毒，依据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差异，可分为17种HA亚型和10种NA亚型。近些年，SIV对全球养猪业造成了严重的经济损失，引起养猪业的普遍关注。国内外学者建立了病毒分离、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(Real-timePCR)、酶联免疫试验(ELISA)、琼脂扩散试验(AGP)等多种方法用于SIV的检测。目前应用最为广泛的检测方法为PCR检测方法。实时荧光定量RT-PCR技术(real-timefluorescencequantitativePCR，QPCR)是在常规RT-PCR技术的基础上发展起来的一种较新的核酸检测技术，具备快速、特异性更强、准确性和灵敏度更高的特点，具有实时性，2-3小时便能得出结果，且不需要PCR后处理，有效降低了过程的污染。脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉和一条静脉构成，是连接母体和子体的天然通道。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，在胎盘屏障的作用下大分子物质通常不能从母体进入脐带血中，因此健康仔猪脐带血中不含有任何抗体，但病毒、内毒素等小分子颗粒能够透过胎盘屏障进入脐带血中，从而垂直传播给仔猪。猪脐带血检测技术具有采样方便、安全省时、不影响生产等优点。结合仔猪脐带血检测的优势，实时荧光RT-PCR检测结果可同时反映母猪、仔猪SIV带毒状况，可对猪群SIV感染和免疫情况进行早期预警评判，进一步有助于猪场做好猪流感的防控工作，降低养殖风险。因此，研制一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR方法，并基于此方法开发检测试剂盒非常有必要，且应用前景广阔。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪SIV带毒状况，评估母猪疫苗的免疫效果，有益于对猪群SIV感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。基于上述目的，本专利技术提供了一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其为SEQIDNO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。在本专利技术中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:1。在本专利技术中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～0.6μM。在本专利技术中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。在RT-PCR反应体系中加入荧光RT-PCR反应液，该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本专利技术的荧光RT-PCR反应液中还含有dNTPs、反转录酶、TaqDNA聚合酶和一些增强成分(MgCl2、DMSO或甲酰胺)的混合物，具体的增强成分根据实际需要进行添加。在本专利技术中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪流感病毒M基因序列的克隆质粒T-SIV-M，克隆质粒T-SIV-M的终浓度为1×105copies/μL～1×107copies/μL。合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光RT-PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。猪流感病毒本身极易变异，而这种变异的分子生物学基础主要是由病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的基因重排而造成，所以在这两个基因序列中很难找出合适的保守基因用于猪流感多种亚型的实时荧光RT-PCR扩增。猪流感病毒的基质蛋白(M)基因相对保守并具有种群特异性，因此在M基因序列中找出一段保守型基因作为实时荧光RT-PCR扩增的靶基因，并使其用于各个亚型猪流感病毒的快速诊断，并且选取M基因作为扩增的模板能兼顾同亚型不同毒株之间的保守序列，保证了检测方法的通用性。本专利技术从猪流感病毒全长M基因上筛选出一段基因片段，该基因片段在猪流感病毒非常保守，大小为142bp，专利技术人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本专利技术的引物和探针。试验结果表明，本专利技术引物和探针的特异性强，能有效从脐带血、血液与组织样品中检测到包括H1和H3亚型流行株在内的A型猪流感病毒。本专利技术所提供的扩增引物对及TaqMan荧光探针可检测不同来源的A型流感病毒，尤其适合检测A型猪流感病毒。在本专利技术中，优选的，所述猪流感病毒M基因的核苷酸序列如下所示：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATGGAAATGGGGACCCGAACAACATGGATAGAGCAGT-3’，其为SEQIDNO:4所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物：5’‑CAATCTTGTCACCTCTGACTAA‑3’，其为SEQ ID NO:1序列；下游扩增引物：5’‑ACTGCTCTATCCATGTTGTTC‑3’，其为SEQ ID NO:2序列；特异性荧光探针：TAMARA‑5’‑CAGTCCTCGCTCACTGGGCA‑3’‑FAM，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。

【技术特征摘要】
1.一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其为SEQIDNO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:1。3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～0.6μM。4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有猪流感病毒M基因序列的克隆质粒T-SIV-M，克隆质粒T-SIV-M的终浓度为1×105copies/μL～1×107...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻正军，李增强，石建，廖娟红，
申请(专利权)人：湖南新南方养殖服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43