一种植生拉乌尔菌以及利用该菌降解土壤中芘的方法技术

一种植生拉乌尔菌以及利用该菌降解土壤中芘的方法，本发明专利技术公开了一种保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2016061的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)菌株在降解多环芳烃芘的用途以及方法。该株微生物具有降解多环芳烃芘的能力，可以用于土壤中多环芳烃的降解，该株微生物不属于现己公开用于多环芳烃降解的专利菌种的任何一种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物应用
，尤其涉及一种利用新的微生物菌株，降解被多环芳烃污染土壤的方法。
技术介绍
多环芳烃(Polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)是一类广泛分布于环境中的含有两个苯环以上的有毒有害污染物，主要来源于人类活动和能源利用过程。迄今为止，多环芳烃仍是数量最多的一类致癌物，在1000多种致癌物中，PAHs占1/3以上，美国环保局已把16种多环芳烃列入优先控制的有毒有机污染物的黑名单中。石油、煤、木材等的燃烧过程和石油、石油化工的生产过程及海上石油开发与石油运输中的溢油等均会造成环境中PAHs的污染，这些PAHs通过废水灌溉、大气降尘等多种途径又进一步导致对土壤的污染。其中，芘(Pyrene，PYR)为四环多环芳烃代表物，在土壤中占有较大的比重，具有遗传毒性，属于美国环保局优先控制的多环芳烃之一。通过废水灌溉、大气降尘等多种途径PAHs进入土壤，近100-150年来，由于化石燃料燃烧和工业的快速发展，土壤PAHs的浓度在不断增加。我国沈抚灌区、天津污灌区、长江三角洲地区、广州市郊耕地土壤均有PAHs积累。土壤中的多环芳烃可以通过接触直接进入人体，或在一定条件下进入大气、水和生物等其他环境介质，危及人类的健康。因此农业环境中PAHs的去除是保障人体健康和农业可持续发展必须解决的问题。生物修复具有经济性强、二次污染少，去除效率高等显著优点，是迄今为止处理烃类污染水体和土壤效果最好的一种方法，在解决PAHs污染问题上具有广阔的应用前景。基于我国土壤PAHs污染现状和环保要求，低费用、高效率的生物修复技术具有很强的工业可行性，将会产生巨大的社会效益和经济效益。生物修复技术最关键的是寻找具有修复功能的微生物，即筛选具有降解多环芳烃的菌株，这将有助于去除环境中PAHs污染，保障农产品安全和人体健康，促进我国经济和环境可持续发展进程。多环芳烃的微生物降解难易程度取决于化学结构的复杂性和降解酶的适应程度，不同的微生物对各类多环芳烃有不同的降解能力。一般说来，PAHs降解性随苯环数量增加而降低。目前，虽已筛选到许多对低环数PAHs的降解菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、黄杆菌属(Flavobacteria)、气单胞菌属(Aeromonas)、微球杆菌属(Micrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)等细菌；毛霉菌(mucorsp.)、青霉菌(penicilliumsp.)、镰刀菌(fusariumsp.)等真菌；对于四环及四环以上PAHs降解菌有红球菌(Rhodococcussp.)、微动假单胞菌(Pseudomonaspaucimobilis)、恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)和脱氮产碱菌(Alcaligenesdenitrificans)，这些菌株具有一定的降解四环及以上多环芳烃能力，但未见植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)降解多环芳烃芘的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对目前对四环和四环以上PAHs的降解菌株资源仍需发掘的实际情况，提供一种降解四环多环芳烃芘效能较高的新微生物菌株。其次，是提供一套将该菌株应用于四环多环芳烃芘污染土壤的方法。一方面，本专利技术提供一种保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M2016061的植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)菌株在降解多环芳烃芘的用途。另一方面，本专利技术提供一种筛选能够降解多环芳烃芘的微生物的方法，该方法包括如下步骤：称取少量土样加入到100ml的筛选培养基中,逐渐提高芘浓度,培养21天后，取上清液均匀涂布于降解菌筛选固体培养基上(芘浓度为100mg/L)，将挑取长势旺盛的菌落，分离获得4株可降解多环芳烃的菌株；经进一步复筛，最终得目标菌株PL7。本专利技术筛选得到的菌株PL7，利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统对菌株进行了94种表型测试，经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株可较强利用1种碳源，对其他70种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株对10种化学物质敏感。16SrDNA序列分析：以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物:p16S-8:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和p16S-1541:5'-aaggaggtgatccagccgca-3'扩增菌株的16SrDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1374bp，将该序列(已提交GenBank，GenBank登记号为KU668567)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)的同源性最高(homology,99％/1374bps,basedon16SrDNA)。经上述Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株PL7为植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)。一种利用新菌株植生拉乌尔菌降解土壤中多环芳烃芘的方法，该方法按以下步骤进行：(1)培养基的配制：蔗糖0.5-8.0g，硫酸铵1.0-5.0g，磷酸二氢钾1.0-8.0g，七水硫酸镁0.1-1.0g，氯化钠0.1-1.0g，酵母粉0.5-5.0g，碳酸钙0.5-5.0g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH值4.0-8.0，经灭菌后，备用；(2)菌种的活化培养：采用步骤(1)培养基，将植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)新菌株PL7(CCTCCNo.M2016061)活化、培养后，得到菌液，备用；(3)菌种发酵培养：将步骤(2)菌液按体积5％接种量接入步骤(1)培养基中；在20℃-40℃，初始pH4.0-8.0，振荡条件下培养24h-72h，至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；(4)土壤样品接菌种与降解：将步骤(3)菌体与含多环芳烃芘的土壤样品按重量5-50︰100的比例，混合，利用菌体降解4-10d；(5)土壤样品中芘含量的分析检测：采用高效液相色谱方法对步骤(4)经菌体降解后的土壤样品进行多环芳烃芘的含量进行分析：土壤样品10.00g加入40.00mL二氯甲烷，40℃以下超声提取2h，离心，吸取上清液20.00mL入平底烧瓶，旋转蒸干，用2.00mL环已烷溶解，吸取0.50mL上硅胶柱(2克硅胶，加入15mL正已烷，湿法装柱)，用正已烷/二氯甲烷混合液(v/v＝1:1)洗脱，弃去第一组分1.00mL，收集第二组分2.00mL，用纯氮吹干，乙腈定容，进行高效液相色谱分析：色谱柱为PAH专用柱，流动相为乙腈：水＝70：30，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行检测，芘的保留时间为10.3min，可测定出样品中芘的含量,并计算出菌种对多环芳烃芘的降解率。优选的，所述的方法，其中所述培养基为：蔗糖5.0g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾8.0g，七水硫酸镁1.0g，氯化钠1.0g，酵母粉2.0g，碳酸钙0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为7.0。优选的，所述的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2016061的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)菌株在降解多环芳烃芘的用途。

【技术特征摘要】
1.一种保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2016061的植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)菌株在降解多环芳烃芘的用途。2.一种利用新菌株植生拉乌尔菌降解土壤中多环芳烃芘的方法，该方法按以下步骤进行：(1)、培养基的配制：蔗糖0.5-8.0g，硫酸铵1.0-5.0g，磷酸二氢钾1.0-8.0g，七水硫酸镁0.1-1.0g，氯化钠0.1-1.0g，酵母粉0.5-5.0g，碳酸钙0.5-5.0g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH值4.0-8.0，经灭菌后，备用；(2)、菌种的活化培养：采用步骤(1)培养基，将植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)的菌株活化、培养后，得到菌液，备用；(3)、菌种发酵培养：将步骤(2)菌液按体积5％接种量接入步骤(1)培养基中；在20℃-40℃，初始pH4.0-8.0，振荡条件下培养24h-72h，至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；(4)、土壤样品接菌种与降解：将步骤(3)菌体与含多环芳烃芘的土壤样品按重量5-50︰100的比例，混合，利用菌体降解4-...

【专利技术属性】
技术研发人员：平立凤，单胜道，袁小利，张敏，柴彦君，庄海峰，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33