番茄红素β‑环化酶基因启动子及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种番茄红素β‑环化酶基因启动子及应用。该番茄红素β‑环化酶基因启动子的序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术从番茄中首次克隆LcyB1基因5’端上游启动子区域序列，并可利用该启动子构建基因表达盒、表达载体、番茄植株细胞以及应用在培育高番茄红素的番茄植株中，较之传统的表达载体，具有更强的特异性，并且由于该启动子来源于番茄，对番茄植株产生的副作用小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一种番茄红素β-环化酶基因启动子及应用。
技术介绍
番茄红素(Lycopene)具有淬灭单线态氧、清除自由基、诱导细胞间连接通讯、调控细胞增殖等多种功能，尤其是对生命体内的超氧自由基的猝灭作用及对某些癌细胞增殖的抑制作用比α-胡萝卜素和β-胡萝卜素更强，因而成为现在最受关注的类胡萝卜素色素之一，是目前国际功能食品研究和化妆品与食品添加剂研究的焦点，有希望成为一个重要的化学防癌物质，对人类健康有重要意义。人体自身不能合成番茄红素，又由于番茄红素在自然界分布的局限性，人体获取番茄红素主要来源是番茄和番茄制品。因而，人们迫切希望有番茄红素含量丰富的植物被发现，或期待培育出番茄红素高富集的番茄新品种。基因工程技术的发展为这一愿望的实现提供了极大可能性。利用基因工程技术培育番茄红素高富集的新型农作物品种具有重要的理论意义和宽广的应用前景，也是目前国际上本领域的研究热点。在高等植物中番茄红素是由八氢番茄红素脱氢转变而来的。番茄红素的代谢途径主要是其环化反应，特别是番茄红素β-环化酶(Lycopeneβ-cyclase)催化其环化形成β-胡萝卜素是其主要代谢途径。Pecker等克隆鉴定了番茄中第一个编码番茄红素β-环化酶的LcyB1基因，发现其表达在果实后熟阶段降低，从而利于果实中番茄红素的积累。目前，通过现代生物技术提高番茄果实中番茄红素含量的研究，多是在植物类胡萝卜素合成过程中过表达正向催化番茄红素前体合成的关键酶基因，希望提高转基因植株中番茄红素的含量，但由于在植物中转入同源序列很强的基因非常容易发生基因静默(Genesilencing)，反而降低番茄红素的合成；且同时由于向番茄红素合成支路的流向增大，往往导致其它以异戊二烯类化合物为前体的合成途径的底物缺乏，而对转基因植株的生长发育造成不利影响，例如组成型表达八氢番茄红素合成酶基因的转基因番茄中，因为与赤霉素的生物合成途径竞争牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)前体导致植株矮化等现象，因而无法应用于农业生产。通过RNAi技术(双链RNA干扰，double-strandedRNAinterference，简称RNAi)可以特异性地敲除(Knockout)番茄花、果实中的番茄红素β-环化酶基因，通过阻断番茄红素的环化反应来终止以番茄红素为底物继续进行的代谢途径，进而生产果实中番茄红素高富集的优质番茄，以期为人们提供新的高价值功能的果蔬食品。但目前用于提高番茄植株中番茄红素含量研究的RNAi载体多是使用的组成型表达载体，如以35SCaMV启动子构建的表达载体等，会对宿主细胞产生副作用影响，并且尚不能时空特异地敲除(Knockout)番茄花、果实中的番茄红素β-环化酶基因，以达到提高果实中番茄红素含量的目的。
技术实现思路
基于此，有必要针对传统的RNAi载体易对宿主细胞产生副作用影响以及特异性差的问题，提供一种特异性的用于敲除番茄花、果实中的番茄红素β-环化酶基因的启动子及应用。本专利技术为上述解决技术问题的方案如下。一种番茄红素β-环化酶基因启动子，该启动子的序列如SEQIDNo.1所示。一种基因表达盒，由依次连接的启动子、目的基因及终止子构成，其特征在于，所述启动子的序列如SEQIDNo.1所示；所述目的基因的序列由依次连接的LcyB1基因的正义序列、连接序列及LcyB1基因的反义序列构成。在其中一个实施例中，所述LcyB1基因的正义序列与所述LcyB1基因的反义序列是以Micro-Tom番茄基因组DNA为模板进行PCR扩增得到，其中，扩增所述LcyB1基因的正义序列所用的引物对的两条引物分别含有SEQIDNo.10与SEQIDNo.11所示的序列，扩增所述LcyB1基因的反义序列的两条引物分别含有SEQIDNo.12与SEQIDNo.13所示的序列。在其中一个实施例中，所述连接序列为PDK内含子序列。在其中一个实施例中，所述终止子为OCS终止子。一种表达载体，含有上述任一实施例所述的基因表达盒。一种RNAi生物制剂，含有上述表达载体。一种番茄植株细胞，含有上述表达载体。上述任一实施例所述的基因表达盒、所述的表达载体、所述的RNAi生物制剂或所述的番茄植株细胞在培育高番茄红素的番茄植株中的应用。一种高番茄红素的番茄植株的培育方法，在培育过程中施加上述表达载体或上述RNAi生物制剂进行RNA干扰，筛选出番茄红素β-环化酶基因敲除的番茄植株，即得。本专利技术从番茄中首次克隆LcyB1基因5’端上游启动子区域序列，并可利用该启动子构建基因表达盒、表达载体、RNAi生物试剂以及番茄植株细胞应用在培育高番茄红素的番茄植株中，较之传统的表达载体，具有更强的特异性，并且由于该启动子来源于番茄，对番茄植株产生的副作用小。附图说明图1为Micro-Tom番茄LcyB1基因启动子区域序列PCR扩增结果，其中，M：DL5000DNAmarker(TaKaRa)，1：LcyB1启动子；图2为pKANNIBAL质粒的结构示意图；图3为pART-LcyB1p-RNAi-LcyB1RNAi双元表达载体构建流程图；图4为pK-LcyB1p质粒PCR及酶切检测结果，其中，M:DL10000DNAmarker(TaKaRa)，1：McrI和XhoI双酶切检测pK-LcyB1p质粒，2：pK-LcyB1p质粒(酶切负对照)，3：PCR检测pK-LcyB1p质粒；图5为pART-LcyB1p-RNAi-LcyB1RNAi双元表达载体PCR及酶切检测结果，其中，M:DL10000DNAmarker(TaKaRa)；1：pART-LcyB1p-RNAi-LcyB1质粒(酶切负对照)；2：XhoI/KpnI双酶切检测；3：HindIII/ClaI双酶切检测；4：NotI酶切检测；5：PCR检测；图6为番茄LcyB1基因启动子调控的LcyB1RNAi植物双元表达载体示意图；图7为番茄新品种转基因体系的建立结果；其中，A为无菌苗；B为无菌苗的子叶外植体；C为农杆菌侵染后外植体再生转基因芽；D为转基因丛生苗；E为转基因丛生苗生根；F、G为再生的完整转基因番茄植株。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术首次从番茄中克隆出番茄红素β-环化酶基因(LcyB1)的启动子，其序列如SEQIDNo.1所示。利用该启动子可以构建番茄细胞特异性的基因表达盒，如图6所示的即为一种基因表达盒，其包括依次连接的启动子、目的基因及终止子。启动子即上述番茄红素β-环化酶基因(LcyB1)的启动子，序列如SEQIDNo.1所示。目的基因的序列包括LcyB1基因的正义序列、LcyB1基因的反义序列以及连接正义序列与反义序列的连接序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番茄红素β‑环化酶基因启动子，其特征在于，该启动子的序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种番茄红素β-环化酶基因启动子，其特征在于，该启动子的序列如SEQIDNo.1所示。2.一种基因表达盒，由依次连接的启动子、目的基因及终止子构成，其特征在于，所述启动子的序列如SEQIDNo.1所示；所述目的基因的序列由依次连接的LcyB1基因的正义序列、连接序列及LcyB1基因的反义序列构成。3.如权利要求2所述的基因表达盒，其特征在于，所述LcyB1基因的正义序列与所述LcyB1基因的反义序列是以Micro-Tom番茄基因组DNA为模板进行PCR扩增得到，其中，扩增所述LcyB1基因的正义序列所用的引物对的两条引物分别含有SEQIDNo.10与SEQIDNo.11所示的序列，扩增所述LcyB1基因的反义序列的两条引物分别含有SEQIDNo.12与SEQIDNo.13所示的序列。4.如权利要求2或3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫爱琼，万小荣，
申请(专利权)人：仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：广东;44