两种人galig重组蛋白的表达及抗血清的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种两种人galig重组蛋白的表达及抗血清的制备方法，属于获得肽的基因工程方法技术领域。优化人Mitogalig和Cytogalig开放阅读框的密码子及其化学合成，制备重组pET‑28b‑mitogalig‑Homo和pET‑28b‑cytogalig‑Homo，并转化至大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导表达；以该重组蛋白为抗原制备小鼠抗血清。人Mitogaligin和Cytogaligin重组蛋白及其抗血清的成功制备为相关肿瘤诊断试剂和抗肿瘤新药物的研发奠定了良好基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种两种人galig重组蛋白的表达及抗血清的制备方法，属于获得肽的基因工程方法

技术介绍
人类半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)由基因LGALS3编码，其中有两个内部基因galig（galectin-3internalgene），它们的开放阅读框（ORF，openreadingframe）与Gal-3的ORF发生部分重叠，但是编码蛋白的氨基酸序列与Gal-3完全不同，其中一种主要分布于线粒体中，故称为mitogalig，编码蛋白为Mitogaligin，另一种主要分布于细胞质中，故称为cytogalig，编码蛋白为Cytogaligin（参见序列1）。已有研究表明，两者均参与细胞凋亡，最终导致细胞死亡。它们可能是通过促进细胞色素c的释放,从而诱导细胞死亡。因此，mitogalig和cytogalig为肿瘤治疗和抗肿瘤药物研发提供新的希望。然而如何很好的实现人mitogalig和cytogalig密码子优化和化学合成，尚未有文献报道。基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有人类半乳糖凝集素-3表达与合成过程中所存在的上述缺陷，本申请根据DNAstar/EditSeq对人mitogalig和cytogalig进行密码子优化并进行化学合成，制备其原核表达重组质粒并诱导其重组蛋白的表达以及制备其小鼠抗血清，为研发抗肿瘤药物以及相关肿瘤诊断制剂奠定基础。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：两种人galig重组蛋白的表达及抗血清的制备方法，具体步骤如下：（1）密码子优化：对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人mitogalig和cytogaligORF进行密码子优化，将优化的mitogalig和cytogaligORF进行化学合成并连接至pET-28b的NdeI和XhoI克隆位点上，制备重组质粒pET-28b-mitogalig-Homo和pET-28b-cytogalig-Homo；（2）重组蛋白的诱导表达①将pET-28b-mitogalig质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，将转化液在含卡那霉素Kanamycin的琼脂盘上划线后37℃培养12h，获得大量单菌落；②在诱导重组蛋白前一天，挑取单菌落接种于1mLLB培养液中，进行12h的前培养；③将前培养按1%的体积接种于20mLLB培养液中，37℃震荡培养至OD600介于0.7～1.0时，取菌液并向其中加入IPTG，然后继续37℃震荡培养后，离心并彻底去上清；④pET-28b-cytogalig-Homo按照上述步骤①-③相同的方法和步骤进行诱导表达。步骤（1）中，所述的优化是指：人mitogalig和cytogaligORF中某氨基酸所对应的密码子是大肠杆菌中出现频率较高的，则保留该密码子；反之，当使用的密码子是大肠杆菌中出现频率很低的或不出现的时，则对其进行优化，将原密码子修改为大肠杆菌的密码子。步骤①中，所述的琼脂盘中，卡那霉素Kanamycin的含量为50μg/mL。步骤②和步骤③中，所述的LB培养液中，卡那霉素Kanamycin的含量为50μg/mL。进一步的，作为优选：步骤③中，所述的IPTG在菌液中的终浓度为0-1mmol/L；添加IPTG后，所述的培养时间为2-3小时。采用上述方法表达的重组蛋白作为抗原，将其与弗氏佐剂充分乳化，所形成的乳化剂注射动物体内，测定效价，1周后心脏采血，分离血清，即为重组蛋白的抗血清，该抗血清于-70℃保存备用。Mitogalig和Cytogalig是人半乳糖凝集素-3（Gal-3）的两个内部基因（galig），分别编码Mitogaligin和Cytogaligin，两者在人体内能够引起线粒体损伤，诱导细胞凋亡，具有良好的治疗肿瘤药物研发的前景。本申请通过优化人Mitogalig和CytogaligORF密码子及其化学合成，制备重组pET-28b-mitogalig-Homo和pET-28b-cytogalig-Homo，并转化至大肠杆菌BL21。IPTG诱导表达结果显示，两种重组质粒均在标准分子量14.3kD的蛋白过量表达，使用抗his-tag抗体的免疫印迹证实其为目的重组人Mitogaligin和Cytogaligin。以该重组蛋白为抗原制备的小鼠抗血清显示良好的特异性。人Mitogaligin和Cytogaligin重组蛋白及其抗血清的成功制备为相关肿瘤诊断试剂和抗肿瘤新药物的研发奠定了良好基础。附图说明图1为本申请中人重组Mitogaligin的诱导表达；图2为本申请中人重组Mitogaligin可溶性检测、Western-blotting检测及其鼠抗血清的特异性检测；图3为本申请中人重组Cytogaligin的诱导表达；图4为本申请中人重组Cytogaligin可溶性检测、Western-blotting检测及其鼠抗血清的特异性检测。其中，图1、图3中，泳道1为未加IPTG的阴性对照，2-4分别为0.001mmol/LIPTG诱导表达2h、3h、4h的样品，5-7分别为0.01mmol/LIPTG诱导表达2h、3h、4h的样品，8-10分别为0.1mmol/LIPTG诱导表达2h、3h、4h的样品，11-13分别为1mmol/LIPTG诱导表达2h、3h、4h的样品；图2中，1-4为考马斯亮蓝染色、5-12为Western-blotting检测，且5-8的一抗为鼠抗6xHis单克隆抗体，9-12为鼠抗人重组Mitogaligin抗血清；泳道1、5、9为未加IPTG的阴性对照，2、6、10为全菌，3、7、11为上清，4、8、13为沉淀；图4中，1-4为考马斯亮蓝染色，5-12为Western-blotting检测，且5-8的一抗为鼠抗6xHis单克隆抗体，9-12为鼠抗人重组Cytogaligin抗血清，泳道1、5、9为未加IPTG的阴性对照，2、6、10为全菌，3、7、11为上清，4、8、13为沉淀。具体实施方式1材料与方法1.1主要材料与试剂大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21购自天根生化科技有限公司；X-Tractor裂解液购自TAKARA；ProteinLadder、脱脂奶粉、PVDF膜、小鼠抗His-tag抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体、超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所；DNA片段合成和载体质粒构建委托苏州金唯智生物科技有限公司。1.2方法1.2.1密码子优化统计实验室常用的重组蛋白原核表达载体，对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人mitogalig和cytogaligORF进行密码子优化。具体而言，两者ORF中某种氨基酸所对应的密码子是大肠杆菌中出现频率较高的，则保留该密码子。反之，如果使用的密码子是大肠杆菌中出现频率很低的或不出现的，则对其进行优化，即将原密码子修改为大肠杆菌的密码子（参见序列2：人Mitogalig密码子优化前后ORF及其编码氨基酸的推导序列和序列3：人Cytogalig密码子优化前后ORF及其编码氨基酸的推导序列）。将优化的mitogalig和cytogaligORF进行化学合成并连接至pET-28b的NdeI和XhoI克隆位点上，制本文档来自技高网...

【技术保护点】
两种人galig重组蛋白的表达方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）密码子优化：对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人mitogalig和cytogaligORF进行密码子优化，将优化的mitogalig和cytogaligORF进行化学合成并连接至pET‑28b的Nde I和Xho I克隆位点上，制备重组质粒pET‑28b‑mitogalig‑Homo和pET‑28b‑cytogalig‑Homo；（2）重组蛋白的诱导表达①将pET‑28b‑mitogalig质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，将转化液在含卡那霉素Kanamycin的琼脂盘上划线后37℃培养12 h，获得大量单菌落；②在诱导重组蛋白前一天，挑取单菌落接种于1 mL LB培养液中，进行12h的前培养；③将前培养按1%的体积接种于20 mL LB培养液中，37℃震荡培养至OD600 介于0.7～1.0时，取菌液并向其中加入IPTG，然后继续37℃震荡培养后，离心并彻底去上清；④pET‑28b‑cytogalig‑Homo按照上述步骤①‑③相同的方法和步骤进行诱导表达。

【技术特征摘要】
1.两种人galig重组蛋白的表达方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）密码子优化：对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人mitogalig和cytogaligORF进行密码子优化，将优化的mitogalig和cytogaligORF进行化学合成并连接至pET-28b的NdeI和XhoI克隆位点上，制备重组质粒pET-28b-mitogalig-Homo和pET-28b-cytogalig-Homo；（2）重组蛋白的诱导表达①将pET-28b-mitogalig质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，将转化液在含卡那霉素Kanamycin的琼脂盘上划线后37℃培养12h，获得大量单菌落；②在诱导重组蛋白前一天，挑取单菌落接种于1mLLB培养液中，进行12h的前培养；③将前培养按1%的体积接种于20mLLB培养液中，37℃震荡培养至OD600介于0.7～1.0时，取菌液并向其中加入IPTG，然后继续37℃震荡培养后，离心并彻底去上清；④pET-28b-cytogalig-Homo按照上述步骤①-③相同的方法和步骤进行诱导表达。2.如权利要求1所述的两种人galig重组蛋白的表达方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的优化...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仙玉，宋源普，吴青青，罗倩玲，蒋桂瑾，岳继萍，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33