用于检测多特异性结合物的结合搭档的方法技术

本文报道了用于检测样品中的多特异性抗体的游离抗原的方法，其中待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：孵育包含游离抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合。

【技术实现步骤摘要】
本申请为2013年1月29日提交的、专利技术名称为“用于检测多特异性结合物的结合搭档的方法”的PCT申请PCT/EP2013/051604的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2014年7月30日，申请号为201380007278.5。本专利技术涉及用于检测/确定样品中的游离的(即，未复合的)多特异性结合物的结合搭档的方法，所述结合搭档(bindingpartner)可以被样品中的多特异性结合物(multispecificbinder)特异性结合，其中在检测游离的结合搭档之前，从样品中耗尽了与多特异性结合物结合的结合搭档。耗尽的多特异性结合物可用于检测/确定复合的结合搭档。专利技术背景含有抗体的标准固相免疫测定涉及在固相上吸附/固定的抗体(捕获抗体)、抗原和针对与酶或可检测的标记(示踪抗体)缀合的抗原的另一表位的抗体之间形成复合物。在测定中，形成夹心物(sandwich)：固相/捕获抗体/抗原/示踪抗体。在夹心物等催化的反应中，抗体-缀合酶的活性与孵育基质中的抗原浓度成比例。抗独特型抗体测定提及在例如US5,219,730；WO87/002778；EP0139389和EP0170302中。Wadhwa,M.等人(J.Immunol.Methods278(2003)1-17)报道了用于检测、测量和表征由生物治疗剂诱导的不理想抗体的对策。EP1917854中报道了用于生产抗独特型抗体的方法。Chen,Y.-P.等人(Clin.Vac.Immunol.14(2007)720-725)报道了通过同时针对人红细胞和乙肝病毒表面抗原的双特异性双抗体介导的凝集测定快速检测乙肝病毒表面抗原。Porter,R.等报道了利用自我装配的单层修饰电极的电活性免疫测定系统(EASI测定)(BiosensorsBioelec.16(2001)9-12)。Berkova,,N.等(Biotechnol.Appl.Biochem.23(1996)163-171)报道了利用hTNF-α和辣根过氧化物酶的双特异性抗体，测量人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)的酶免疫测定法的发展。在EP0962771中，还报道了用于相同目的的检测装置和方法。Reinhartz，H.W.等(Analyst121(1996)767-771)报道了通过实时相互作用分析研究的双特异性多价抗体，用于研发抗原-抑制的酶联免疫吸附测定。Doppalapudi，V.R.等(Proc.Natl.Acad.Sci.107(2010)22611-22616)报道了化学生成双特异性抗体。专利技术概述本文报道了用于检测样品中的游离(即，未复合的)结合搭档的存在，或用于确定样品中的游离(即，未复合的)结合搭档的量的方法，所述结合搭档可以被多特异性结合物至少一个结合特异性，即，第一结合特异性特异的结合。已发现，在确定游离的结合搭档的量之前，从样品中耗尽被多特异性结合物特异的结合的结合搭档，即，结合搭档-多特异性结合物-复合物，是有利的。本文报道的方法通过如下孵育样品，实现耗尽多特异性结合物，所述样品或者与结合搭档(即，第二结合搭档)孵育，所述结合搭档可以被多特异性结合物的不同(即，第二)结合特异性所特异的结合，所述结合特异性不结合待确定的结合搭档(即，第一结合搭档)；所述样品或者与单特异性结合物结合，所述单特异性结合物特异的结合多特异性结合物的一个结合特异性，借此，单特异性结合物特异结合多特异性结合物的结合特异性，该结合特异性不结合待确定的结合搭档(参见图2)。本文报道的一个方面是用于确定样品中的双特异性抗体的(第一)抗原的存在和/或量的体外方法，借此待检测的抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，从而使抗原与双特异性抗体复合(抗原-双特异性抗体-复合物)，包括步骤：-孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合。在一个实施方案中，方法包括步骤：-孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和-检测抗原-双特异性抗体-抗独特型抗体的复合物，从而确定双特异性抗体的抗原的存在和/或量。在一个实施方案中，方法包括步骤：-孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和-孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。在一个实施方案中，方法用于确定与双特异性抗体复合的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。在一个实施方案中，方法包括下列步骤：-提供包含抗原和双特异性抗体的样品，其中至少90％的抗原与双特异性抗体复合，-孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和-孵育在第一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。在一个实施方案中，方法包括下列步骤：-孵育包含抗原和双特异性抗体的样品与一定量的双特异性抗体，以提供其中至少90％的抗原被双特异性抗体复合的样品，-孵育包含被双特异性抗体复合的抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和-孵育在前一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量。在一个实施方案中，双特异性抗体的量为约1μg/ml至10μg/ml，优选约1.5μg/ml。在一个实施方案中，双特异性抗体的量是1mg/ml样品。在一个实施方案中，至少95％的抗原是与双特异性抗体复合的。在一个实施方案中，至少98％的抗原是与双特异性抗体复合的。本文报道的一个方面是用于确定样品中的双特异性抗体的结合抗体的(第一)抗原的量的体外方法，借此抗原可以被双特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：-孵育第一等份的包含抗原和双特异性抗体的样品与一定量的双特异性抗体，以提供其中至少90％的抗原被双特异性抗体复合的样品，-孵育包含被双特异性抗体复合的抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和-孵育在前一步中形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合抗原的抗体，从而确定样品中的双特异性抗体的抗原的存在和/或量，和确定样品中存在的抗原总量，-孵育第二等份的包含抗原和双特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合双特异性抗体的不同于第一结合特异性的第二结合特异性，其中抗独特型抗体被固相结合，和-孵育形成的复合物与在不同于双特异性抗体所结合表位的表位上特异的结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于体外确定结合搭档(抗原、靶、被分析物)的存在和/或量的方法，所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，其中，在检测结合搭档前，通过孵育样品与第二结合搭档或特异结合多特异性结合物的第二结合特异性的单特异性结合物，耗尽存在于样品中的与多特异性结合物结合的结合搭档部分，所述第二结合搭档可以被多特异性结合物的第二结合特异性特异的结合。

【技术特征摘要】
2012.02.01 EP 12153457.2;2012.08.31 EP 12182505.31.用于体外确定结合搭档(抗原、靶、被分析物)的存在和/或量的方法，所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，其中，在检测结合搭档前，通过孵育样品与第二结合搭档或特异结合多特异性结合物的第二结合特异性的单特异性结合物，耗尽存在于样品中的与多特异性结合物结合的结合搭档部分，所述第二结合搭档可以被多特异性结合物的第二结合特异性特异的结合。2.用于确定多特异性结合物的(第一)结合搭档的存在和/或量的体外方法，其中所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异的结合，包括步骤：-孵育包含(第一)结合搭档和多特异性结合物的样品与第二结合搭档，所述第二结合搭档可以被多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异的结合。3.使用免疫测定用于免疫学确定样品中的多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的方法，其中在确定结合搭档之前，从样品中耗尽多特异性结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：KG·施图本拉赫，U·韦塞尔斯，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH