具有增强活性的外切葡聚糖酶变体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及参与分解木质纤维素生物质的酶的表达和优化。本发明专利技术具体涉及里氏木霉的外切葡聚糖酶2的变体以及所述具有增强功效的变体在用于分解纤维素和用于生产生物燃料的方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由于大量原料的可利用性和乙醇作为燃料的优势，用纤维素生产乙醇的可能性已经得到很大的关注。用于这类工艺的基于纤维素的天然原料被称为“生物质”。已经将许多类型的生物质，例如木材、农业残余物、草本作物和城市固体垃圾，考虑作为生产生物燃料的潜在原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素是由β-1,4键连接的葡萄糖分子组成的聚合物，其对分解或解聚合非常有耐性。一旦纤维素转化为葡萄糖，后者容易用酵母发酵成生物燃料，如乙醇。研究的用于将纤维素转化为葡萄糖的最古老的方法是基于酸水解。该工艺可以在浓酸或稀酸的存在下进行。然而，几个缺点(例如当使用浓酸时酸回收率很差，以及使用稀酸的情况下葡萄糖的产量低)对于酸水解工艺的经济性是不利的。为了克服酸水解工艺的缺点，最近的纤维素转化工艺已经更多地与使用纤维素酶类型的酶的酶促水解相关。然而，该木质纤维素生物质(如纤维素)的酶促水解的缺点是其工业生产工艺较为昂贵。因此，有必要使用日益有效的分泌纤维素酶的微生物菌株。在这方面，很多微生物包含水解纤维素的酶，例如真菌-木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergilus)、腐质霉属(Humicola)、或镰刀菌属(Fusarium)，以及细菌例如高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacilus)、纤维单胞菌属(Celulomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。由这些微生物分泌的酶具有用于将纤维素转化为葡萄糖的三种不同类型的活性，可以分为三组：随机攻击纤维素纤维内部的内切葡聚糖酶，攻击纤维末端释放纤维二糖的外切葡聚糖酶，和将该纤维二糖水解为葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。其他类型的酶，例如半纤维素酶或最近发现的一类多糖单加氧酶也可以在水解功效中起作用。工业上强烈需要降低酶促水解的成本，而这种将低涉及使用降低的酶剂量，从而使用更有效的酶鸡尾酒。因此，一些专利申请描述了活性高于里氏木霉(Trichodermareesei)的天然酶或通过基因工程改进的变体。可以提及的有涉及外切葡聚糖酶的专利申请US2010304464、WO2010/066411和WO2013/029176，涉及内切葡聚糖酶的申请WO2007/109441、WO2012/149192和WO2010/076388，涉及β-葡萄糖苷酶的申请WO2010/029259、WO2010/135836或WO2010/022518，或涉及多糖单加氧酶的申请WO12135659和WO12149344。主要基于结构标准，水解木质纤维素生物质的酶在CAZy系统中分类(Cantarel,B.L.,Coutinho,P.M.,Rancurel,C.,Bernard,T.,Lombard,V.,&Henrissat,B.(2009).TheCarbohydrate-ActiveEnZymesdatabase(CAZy):anexpertresourceforGlycogenomics.Nucleicacidsresearch,37,D233-8)。外切葡聚糖酶可属于GH6、7、9、48和74家族。为了使木质纤维素生物质水解有效且具有经济效益，酶混合物必须包含平衡比例的具有各种酶活性的酶，特别包括但不排除外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶类型。举例而言，在里氏木霉的天然混合物中，一般注意到存在60-70％的外切葡聚糖酶、15-20％的内切葡聚糖酶、几个百分点的半纤维素酶和约的5-10％的β-葡萄糖苷酶。该混合物适于以可接受的收率水解大部分经预处理的物质(例如在酸条件下汽爆的小麦秸秆类型)。在混合物中已经存在相当比例的外切葡聚糖酶表明，增加这些酶的量而不损害其他活性将非常困难。里氏木霉的基因组包含两种外切葡聚糖酶，一种来自家族6(CBH2,cel6a)，另一种来自家族7(CBH1,Cel7a)。它们分别将纤维素的非还原(EC3.2.1.176)和还原(EC3.2.1.91)末端水解为纤维二糖。水解和发酵可以根据各种方案进行。最常见的由独立的水解和发酵(SHF)组成。该方法能够通过维持最佳反应条件来优化各个步骤。该发酵在约28℃至约30℃的温度即时进行，而水解一般在至少45℃的温度进行。然而，在SHF中，在反应结束时释放的糖浓度非常高，导致对酶的抑制，降低了该方法的效率。为了避免这些缺点，可以设想另一种方法。在SSF中，两个步骤(己糖的水解和发酵)同时发生，防止糖积聚到抑制酶的浓度。由于使用单一反应器，投资成本也降低了。由于没有抑制，水解率更高，因为释放的糖立即被用于发酵成乙醇。在该方法中，反应器的温度必然在水解和发酵的最佳温度之间形成平衡，一般在约30℃至约35℃。然而，纤维素分解酶的活性在该温度降低约30％。SSF也允许分解纤维素的酶在发酵糖的生物中表达，从而能够限制，或在极端情况下消除在单独步骤产生的酶的来源。因此，获得在水解和发酵的最佳温度(即，30℃-50℃)下保留有效的外切葡聚糖酶活性的酶，同时保持混合物中所有酶的比例，对将木质纤维素生物质转化为生物燃料的工艺而言是显著的增益。本专利技术人已经开发了具有增强的外切葡聚糖酶活性的多肽，尤其是与序列SEQIDNO：2的CBH2参考蛋白的外切葡聚糖酶活性相比。CBH2对应于来自里氏木霉的外切葡聚糖酶2。在这方面，值得赞扬的是，申请人在大量研究后已经分离或纯化与CBH2参考蛋白(SEQIDNO：2)的外切葡聚糖酶活性相比，外切葡聚糖酶活性增强的多肽。因此，本专利技术涉及选自以下的多肽：i.选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26和SEQIDNO:28的氨基酸序列；和ii.与序列SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26和SEQIDNO:28相比具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％百分比的相同残基(同一性百分比)的氨基酸序列。优选的，上述多肽的特征在于，其在发酵生物中的表达至少与CBH2参考蛋白(SEQIDNO：2)的表达相等。根据本专利技术，给定序列相对于SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28的同一性百分比对应于该给定序列与SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28之间相同的残基数除以SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28的残基数。在一个优选的实施方案中，在约35℃和/或约50℃的温度下，与氨基酸序列SEQIDNO：2的CBH2多肽的外切葡聚糖酶活性相比，本专利技术的多肽的外切葡聚糖酶活性增强至少10％，优选至少20％，优选至少30％，甚至更优选至少40％。例如，本领域技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离或纯化的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2的CBH2参考蛋白的外切葡聚糖酶活性相比，它具有增强的外切葡聚糖酶活性，所述多肽选自：i.选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和ii.与序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28相比，具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性百分比的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.20 FR 14557011.一种分离或纯化的多肽，其特征在于，与SEQIDNO：2的CBH2参考蛋白的外切葡聚糖酶活性相比，它具有增强的外切葡聚糖酶活性，所述多肽选自：i.选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26和SEQIDNO:28的氨基酸序列；和ii.与序列SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26和SEQIDNO:28相比，具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性百分比的氨基酸序列。2.一种纯化或分离的核酸，其特征在于，它编码至少一种如权利要求1所述的多肽。3.如权利要求2所述的纯化或分离的核酸，选自以下序列：SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25和SEQIDNO:27。4.一种载体，其特征在于，它包含至少一种如权利要求2或3所述的核酸。5.一种分离的宿主细胞，其特征在于，它包含至少一种如权利要求1所述的多肽，或至少一种如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·佩尔西永，C·于尔曼，C·艾林哈克，O·邦宗，A·马尔若，H·马蒂斯，S·福尔，S·阿尔芒，S·普拉多，
申请(专利权)人：IFP新能源公司，普鲁泰斯公司，国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国;FR