诱变方法技术

在一些实施方案中，本公开内容的一些方面提供了可用于对细胞内基因组基因座的一个或更多个等位基因进行修饰(例如，突变)的方法和组合物。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及产生嵌合的剪接RNA分子，所述RNA分子包含剪接至核酸酶相互作用RNA区段的经转录的外显子。在一些实施方案中，嵌合的剪接RNA在细胞中指导DNA修饰酶(例如，核酸酶)到基因组基因座，从而导致所述基因座的修饰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请根据35U.S.C.§119要求于2014年1月14日提交的美国临时申请序列号61/927,458的优先权，其全部内容并入本文。
技术介绍
使用位点特异性指导RNA(guideRNA)可将RNA指导的核酸酶(RNA-guidednuclease)(例如，Cas9)靶向目的特定基因组靶位点。位点特异性指导RNA可被设计为包含i)与目的基因组靶位点的一条链互补的靶区段和ii)与RNA指导的核酸酶相互作用的核酸酶相互作用区段。使用时，所述指导RNA的靶向区段与靶基因组位点的互补序列结合，而且所述指导RNA的核酸酶相互作用区段将RNA指导的核酸酶募集到基因组靶位点，从而导致在该位点处的靶向核酸切割(例如，双链切割)。在许多细胞中，通过可在切割位点处引入突变的细胞内修复机制修复基因组位点的切割。因此，RNA指导的核酸酶可用于在已知的目的位点处引入基因组突变。
技术实现思路
使用RNA指导的核酸酶来产生基因组突变的当前系统受限于需要鉴定靶位点并通过设计将其并入指导RNA中。相反，本文所述的系统可用于向任何表达的基因组位点引入突变，而不需为每个基因组位点设计特异性合成指导RNA或编码特异性合成指导RNA的DNA构建体。更确切地说，本文所述的系统以可剪接至由基因组基因座转录的外显子上(在外显子下游)的构造提供核酸酶相互作用区段以产生嵌合的剪接RNA，所述嵌合的剪接RNA可使核酸酶靶向基因组基因座。在一些实施方案中，将编码剪接受体位点下游核酸酶相互作用RNA区段的插入核酸构建体整合到基因(例如，基因的内含子)中。因此，基因的转录，随后剪接转录的RNA，产生了嵌合的剪接RNA，所述嵌合的剪接RNA包含至少一个剪接至核酸酶相互作用RNA区段的基因的外显子。该嵌合的剪接RNA可以i)靶向对应基因组基因座的一个或更多个等位基因(通过嵌合的剪接RNA的一个或更多个外显子与对应的基因组基因座的互补链之间的碱基配对)和ii)将RNA指导的核酸酶募集至一个或更多个等位基因(通过与嵌合的剪接RNA的核酸酶相互作用区段的相互作用)，从而促进在基因组基因座的一个或更多个等位基因处基于核酸酶的切割。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶在被嵌合的剪接RNA分子所靶向的外显子的3’端或附近切割基因组基因座(经由与嵌合的剪接RNA分子的靶向部分进行互补碱基配对，通过与外显子结合的嵌合的剪接RNA分子将RNA指导的核酸酶指导到该位置)。应理解，在细胞中嵌合的剪接RNA分子可与基因组基因座的每个等位基因(例如，在二倍体细胞中的两个等位基因)上的对应外显子结合。因此，通过RNA指导的核酸酶可在相同位置处靶向表达的基因组基因座的每个等位基因，结果可在表达的基因组基因座之每个等位基因中的相同位置处引入突变。因此，应理解，如本文所述可突变两个或更多个等位基因(例如，多倍体细胞的3、4、5、6或更多个等位基因)。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于在表达的多个基因座的两个等位基因中均产生突变，其中每个基因座均产生具有剪接供体位点的转录物，并且其中表达在能够进行RNA剪接的宿主细胞内发生。例如，本文所述的组合物和方法在真核宿主细胞中是可用的。在一些实施方案中，宿主细胞是体外的。在一些实施方案中，宿主细胞是体内的。在一些实施方案中，宿主细胞是生物体(例如哺乳动物，如小鼠、非人灵长类动物或人)中的细胞。真核宿主细胞的非限制性实例包括哺乳动物、鸟类、昆虫、酵母、植物和其他真核宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人宿主细胞。宿主细胞的非限制性实例包括但不限于：干细胞、上皮细胞、内皮细胞等。在一些实施方案中，宿主细胞是人干细胞。本文所述的组合物和方法可用于产生在多个不同的表达的基因组基因座之每个基因座处均具有突变的宿主细胞文库。可通过以下方法产生文库：将本公开内容的插入核酸构建体递送(例如，通过转染)至宿主细胞，然后分离含有其中已插入一个或更多个核酸构建体之DNA的细胞。通过调节转染过程中与细胞混合的插入核酸构建体的比可产生具有不同数目突变的宿主细胞。在一些实施方案中，文库中的每个突变细胞在二倍体细胞的一个或两个等位基因(或在更高倍性(例如3n、4n、5n、6n、7n、8n等倍性)的细胞的多个等位基因)的仅一个基因组基因座处平均具有一个突变。应理解，当二倍体细胞的两个等位基因均发生DNA断裂修复时，在每个等位基因中引入的突变可以不同。然而，在一些实施方案中，二倍体细胞文库中的每个突变细胞在一个或两个等位基因的两个或更多个不同基因组基因座处平均具有一个突变。在一些实施方案中，二倍体细胞文库中的每个突变细胞在单个基因组基因座的两个等位基因处平均具有一个突变。还应理解，在给定的基因组基因座处可产生不同的突变并且其可存在于文库中的不同宿主细胞中。例如，本文所述的插入构建体可整合到表达的基因组基因座的不同位置(例如，内含子)中，并因此在基因组基因座的不同外显子中(例如，在每个不同外显子的3’端)产生突变。在一些实施方案中，产生具有许多不同细胞的文库，所述细胞各自具有不同的整合位点。在一些实施方案中，产生具有许多细胞的文库，所述细胞多至103、102至104、102至105、102至106、102至107、102至109、103至106、103至107、104至106、104至107或104至108，其各自具有不同的整合位点。在一些实施方案中，可通过选择出在特定种类的基因内具有插入(随机或靶向)的细胞来构建并设置文库以使其包含不同种类的基因。例如，文库的细胞可在编码调控因子、代谢因子、发育因子、受体(例如，免疫检查点受体、G-蛋白偶联受体)、酶(例如，激酶、磷酸酶)、转录因子、结构蛋白、动力蛋白的基因以及其他种类基因，包括编码调控RNA(例如miRNA，非编码RNA(例如，IncRNA)等)的基因内具有插入。在一些实施方案中，可筛选基因组突变的文库以鉴定对用一种或更多种候选化合物的处理敏感的一个或更多个基因座。然而，应理解，可使用任何测定来筛选突变的文库以鉴定与目的表型或性质相关的一个或更多个基因座。本专利技术的一些方面涉及在能够进行剪接的细胞(例如真核细胞)中产生能够指导DNA核酸酶到基因组靶标之靶特异性RNA分子的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将重组核酸引入到真核细胞中，其中所述重组核酸包含第一核酸区域，所述第一核酸区域编码第二核酸区域上游的剪接受体位点，所述第二核酸区域编码能够与RNA指导的DNA核酸酶相互作用的RNA区段。在一些实施方案中，所述方法包括将重组核酸整合到真核细胞的基因组基因座中，其中所述重组核酸包含第一核酸区域，所述第一核酸区域编码第二核酸区域上游的剪接受体位点，所述第二核酸区域编码能够与RNA指导的DNA核酸酶相互作用的RNA区段。本专利技术的一些方面提供了促进细胞内基因组DNA的RNA指导之切割的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在细胞中产生包含剪接至第二RNA区段之第一RNA区段的RNA分子，其中所述第一RNA区段包含由基因组基因座转录的外显子序列且所述第二RNA区段包含能够与RNA指导的DNA核酸酶相互作用的RNA区段。在一些实施方案中，所述方法还包括在细胞中表达RNA指导的DNA核酸酶。本专利技术的一些方面涉及在真核细胞中产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
在真核细胞中产生能够指导DNA核酸酶到基因组靶标之靶特异性RNA分子的方法，所述方法包括将重组核酸引入真核细胞中，其中所述重组核酸包含第一核酸区域，所述第一核酸区域编码第二核酸区域上游的剪接受体位点，所述第二核酸区域编码能够与RNA指导的DNA核酸酶相互作用的RNA区段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.14 US 61/927,4581.在真核细胞中产生能够指导DNA核酸酶到基因组靶标之靶特异性RNA分子的方法，所述方法包括将重组核酸引入真核细胞中，其中所述重组核酸包含第一核酸区域，所述第一核酸区域编码第二核酸区域上游的剪接受体位点，所述第二核酸区域编码能够与RNA指导的DNA核酸酶相互作用的RNA区段。2.在真核细胞中产生能够指导DNA核酸酶到基因组靶标之靶特异性RNA分子的方法，所述方法包括将重组核酸整合到真核细胞的基因组基因座中，其中所述重组核酸包含第一核酸区域，所述第一核酸区域编码第二核酸区域上游的剪接受体位点，所述第二核酸区域编码能够与RNA指导的DNA核酸酶相互作用的RNA区段。3.促进细胞内基因组DNA的RNA指导之切割的方法，所述方法包括：在真核细胞中产生RNA分子，所述RNA分子包含第一RNA区段，所述第一RNA区段剪接至第二RNA区段，其中所述第一RNA区段包含由基因组基因座转录的外显子序列且所述第二RNA区段包含能够与RNA指导的DNA核酸酶相互作用的RNA区段，以及在所述真核细胞中表达所述RNA指导的DNA核酸酶。4.权利要求1或2所述的方法，其中所述重组核酸是DNA分子。5.权利要求1或2所述的方法，其中所述重组核酸包含转座子末端序列。6.权利要求5所述的方法，其中所述转座子末端序列包含反向末端重复序列(ITRs)。7.权利要求5或6所述的方法，其中所述转座子末端序列包含同向末端重复序列。8.根据从属于权利要求6的权利要求7所述的方法，其中所述同向末端重复序列在ITRs的侧翼。9.权利要求5所述的方法，其中所述转座子末端序列包含5’末端CCY和3’末端GGG。10.权利要求9所述的方法，其中所述转座子末端序列包含5’末端CCC和3’末端GGG。11.权利要求5所述的方法，其中所述转座子末端序列靶向TTAA插入位点。12.权利要求5所述的方法，其中所述转座子末端序列包含PiggyBac转座子特异性反向末端重复序列(ITRs)。13.权利要求5所述的方法，其中所述转座子末端序列包含Tagalong转座子特异性反向末端重复序列(ITRs)。14.权利要求1或2所述的方法，其中所述重组核酸还包含编码选择或筛选标志物的第三核酸区域。15.权利要求14所述的方法，其中所述选择或筛选标志物是抗生素抗性蛋白或者荧光蛋白或生物发光蛋白。16.权利要求1或2所述的方法，其中所述剪接受体位点包含如5’-X1X2X3-3’所示的序列，其中：X1是A，X2是G或C，并且X3是A、G、C或U，其中3’剪接点在X2和X3之间。17.权利要求16所述的方法，其中X2是G。18.权利要求16或17所述的方法，其中X3是A、G或C。19.权利要求1或2所述的方法，其中所述剪接受体位点包含如5’-X1X2X3X4X5-3’所示的序列，其中：X1是A、C或U，X2是A，X3是G，X4是A、G或C，并且X5是A、U或C，其中3’剪接点在X3和X4之间。20.权利要求1或2所述的方法，其中所述剪接受体位点包含如5′-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22-3′(SEQIDNO：18)所示的序列，其中：X1、X3、X5、X7、X9、X12、X15、X16和X17各自独立地选自：A、G、C和U，X2是C或G，X4是U，X6、X8、X10、X11、X13、X14各自独立地选自：G、C和U，X18是A、...

【专利技术属性】
技术研发人员：许田，乔纳森·M·罗思伯格，
申请(专利权)人：LAM疗法公司，
类型：发明
国别省市：美国;US