高通量量化及分析病毒和相关产物的方法技术

本发明专利技术提供了一种高通量的方法使用层析系统和同轴动态光散射(DLS)技术以量化病毒及病毒分子和分析其大小和完整性。在一个实施例中，本发明专利技术的方法量化和分析包膜病毒、无包膜病毒、活病毒、减毒活病毒、灭毒病毒、重组病毒或病毒样颗粒的大小和完整性。在一个实施例中，本发明专利技术包括一个用于运行多个层析柱的切换系统以同时进行多个分析。本发明专利技术还提供了一种方法来开发和评估包含病毒的产品以防止病毒疾病。在另一个实施例中，本发明专利技术的方法用于监控制造病毒疫苗过程中的质量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本专利申请以申请号为62/009,126在2014年6月6日申请的美国专利申请作为优先权。上述专利申请的所有内容和公开都结合在本申请中。在本专利申请中所引用的各参考文献和公开都在此合并到本专利申请中从而更全面地描述本专利技术从属的

本专利技术涉及病毒(viruses)、病毒颗粒(viralparticles)、病毒样颗粒(virus-likeparticle,“VLPs”)和重组病毒载体(recombinantviralvectors)的量化和分析。本专利技术还涉及用于预防由包膜或无包膜病毒引起的感染性疾病的产品的开发以及含有包膜或无包膜病毒或病毒样颗粒的产品的评估。本专利技术还涉及用于基因治疗应用的产品的开发以及含有用于基因治疗的重组病毒载体的产品的评估。
技术介绍
病毒的复制与繁殖需要依靠原核或真核细胞来进行。当病毒接触到易感细胞时，它会附着于该细胞，然后进入其中。一旦进入细胞后，病毒就会劫持细胞的蛋白质合成机器并命令其生成所需的成分来组装更多的病毒拷贝。经过一段时间后，病毒拷贝会通过使细胞破裂或通过细胞膜出芽的方式离开细胞。病毒可根据不同的分类标准进行分类，其中是否具有或缺乏磷脂双层包膜是进行分类最关键的标准。在人类和兽类病原体中均可找到包膜和无包膜病毒。口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)引起的口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)，是由无包膜病毒引起的最重要的兽类疾病之一。牛轮状病毒(Rotaviruses)可导致新生牛犊腹泻，是另一个无包膜病毒的例子，对牲畜生产力引致重大的影响。一些引起兽类疾病的包膜病毒的例子包括：牛疱疹病毒-1型(BovineHerpesviruses1，BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BovineHerpesviruses5，BoHV-5或BHV-5)，为可分别导致传染性牛鼻气管炎和牛疱疹性脑炎的病原体；与牛呼吸道疾病综合症(Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRD)相关的牛副流感病毒-3型(BovineParainfluenzaVirus3，PI3或BPIV-3)；可在动物和人类中引起致死性脑炎的狂犬病病毒(RabiesVirus)。口蹄疫是一种严重且高度传染性的疾病，可影响内偶蹄类动物包括：牛、猪、绵羊、山羊和鹿。口蹄疫的症状包括发热，位于口中、脚上和乳头上的水泡，产奶量下降，食欲不振，体重下降，以及跛行。口蹄疫在全球多个地方流行，但并不被认为是人畜共患病。世界动物卫生组织(OIE)定期发布疾病分布和爆发图。由于世界动物卫生组织制定的市场限制,该组织所发布的卫生状况对肉类贸易依赖型经济的国家(特别是受口蹄疫影响的国家)产生了深远的经济影响。口蹄疫病毒(FMDV)是一种无脂质包膜的单链核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)病毒，呈二十面体对称，直径大小为28-40nm。该病毒属于小核糖核酸病毒科的口瘡病毒属。整个病毒的颗粒在体外极度不稳定，在温度高于56℃和pH值小于6时会分离成单分子。现已知的口蹄疫病毒血清型有7种，分别为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型。大多数发达国家通过有效的疫苗和严格的监控计划成功根除了口蹄疫，但即使制定了严格的国际贸易政策，口蹄疫最近在欧洲(2000及2001年)和日本(2000及2010年)仍发生了大规模爆发。制造这些疫苗的厂房需符合OIE的NBS生物安全等级4的要求。估计每年全球生产的口蹄疫疫苗数量為25至30亿劑。轮状病毒是导致新生牛犊腹泻的最常见病因。轮状病毒性腹泻通常影响四天至三周龄的牛犊，导致它们反应迟钝，不愿饮水。疾病过程通常持续4至8天，受感染牛犊极有可能出现抑郁、脱水和继发感染的症状。受感染牛犊还会有食欲下降甚至流口水的症状。若无任何治疗，轮状病毒致死率可高达50％。牛犊腹泻对畜牧业的经济影响是非常巨大且深远的：除了额外的劳动力、药物经费和牛犊死亡有关的成本，还会有受感染牛犊长期表现不佳所造成的潜在经济影响。据研究表明，在从出生到第21天的牛犊中，80％的牛犊发病率与腹泻有关。牛轮状病毒是一种属于呼肠孤病毒科的无包膜双链RNA病毒。该病毒体呈二十面体状并且具有三重蛋白质衣壳结构，直径约为80nm。对母牛进行轮状病毒疫苗接种是对抗疾病和防止新生牛犊腹泻的有效方法。用一般在产犊前1-3月为母牛接种轮状病毒疫苗，然后用该母牛的初乳喂养新生牛犊。感染牛疱疹病毒的牛可导致严重的疾病。传染性牛鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)是由牛疱疹病毒-1型(BHV-1或BoHV-1)引起的高度传染性的呼吸道疾病。牛疱疹病毒-5型(BHV-5或BoHV-5)与牛疱疹病毒-1型的向性不同：牛疱疹病毒-5型是幼牛中脑膜炎的病原体。牛疱疹病毒-1型和牛疱疹病毒-5型是包膜双链DNA病毒，属于水痘病毒属和疱疹病毒科。它们具有从球形到多形态的形状，其直径为150-200nm。它们内部的蛋白衣壳由162个壳体组成，被无定型膜包围。传染性牛鼻气管炎(IBR)可以影响幼牛和老牛。除了引起呼吸道疾病，这种病毒还会引起结膜炎、流产、脑炎和广泛的全身性感染。传染性牛鼻气管炎的特征在于上呼吸道的急性炎症。第一次感染后，病毒永远不会完全清除。病毒会终身潜伏(隐藏)在被感染动物的大脑神经细胞。然而，在压力影响下，病毒会再次开始繁殖，通常在鼻子和眼睛重新分泌。因此，被感染的动物绝不安全。购买已被感染的动物是新感染的主要来源。由于病毒引起的疾病十分严重，以致构成了国际贸易的障碍。由于牛疱疹病毒-1型是广泛存在的高度传染性的病毒，因此一旦牛的被动免疫消失时接种疫苗，通常建议在出生后4至6个月。目前可用于传染性牛鼻气管炎的疫苗包括改造活毒(Modified-live-virus，MLV)疫苗和灭活或非活性病毒(killed-virus，KV)疫苗。牛副流感-3(PI3)是牛群中广泛存在的高度传染性呼吸道疾病。该疾病与牛呼吸道疾病综合症(bovinerespiratorydiseasecomplex，BRD)相关。单独感染牛副流感病毒-3(PIV-3)只会引起轻度疾病。临床症状包括发烧、咳嗽、水状鼻腔和泪腺排出物、以及呼吸速率增加和呼吸声增强。感染会增加其他病毒疾病的发病率，例如牛病毒性腹泻和感染性牛鼻气管炎。当同时感染继发细菌性肺炎时，会导致牛副流感-3型(PI-3)的影响更显著。副流感病毒-3型(PIV-3)是负链RNA包膜病毒，属于副粘病毒科的呼吸道病毒属。该病毒具有球形形状并且直径约为150nm。接种疫苗是防止副流感-3影响的最佳方式。大多数副流感-3疫苗会与其他呼吸道病毒进行组合，例如牛疱疹病毒-1型(BHV-1)。该病毒的疫苗现有改造活毒或灭活两种形式。狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患病，可由动物传染至人类。该病毒属于弹状病毒科的狂犬病病毒属。狂犬病病毒是类似子弹状的包膜负链RNA病毒，长约180nm，横截面直径约为75nm。所有哺乳动物都有可能被狂犬病病毒感染。家犬是该病毒最主要的携带者，95％因狂犬病而死亡的人类是通过狗而受感染的。狂犬病的麻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于量化和分析一种或多种病毒或病毒颗粒的方法，包括以下步骤:a)使用一种或多种酶处理包含所述病毒或病毒颗粒的原始样本,以获得多个病毒样本；b)将第一个病毒样本置于一个层析系统内,所述层析系统包括多个泵和多个层析柱，其中i)第一个泵通过第一个阀门连接到第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过第二个阀门连接到一个检测系统,所述检测系统包含一个动态光散射检测器和一个紫外线检测器；以及ii)第二个泵通过所述第一个阀门连接到第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到废物收集匣,其中当所述第一个病毒样本在第一个层析柱中运行时，清洗缓冲液在第二个层析柱中运行；c)从所述第一个层析柱洗脱所述第一个病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第一个病毒样本；d)切换所述第一个泵和第二个泵的连接,其中i)所述第一个泵通过所述第一个阀门连接到所述第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述检测系统；以及ii)所述第二个泵通过所述第一个阀门连接到所述第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述废物收集匣；e)将第二个病毒样本注入所述第二个层析柱，并将清洗缓冲液注入所述第一个层析柱；f)从所述第二个层析柱洗脱所述第二个病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第二个病毒样本；以及g)重复步骤(b)至(f)，以量化和分析所述多个病毒样本。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.06 US 62/009,1261.一种用于量化和分析一种或多种病毒或病毒颗粒的方法，包括以下步骤:a)使用一种或多种酶处理包含所述病毒或病毒颗粒的原始样本,以获得多个病毒样本；b)将第一个病毒样本置于一个层析系统内,所述层析系统包括多个泵和多个层析柱，其中i)第一个泵通过第一个阀门连接到第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过第二个阀门连接到一个检测系统,所述检测系统包含一个动态光散射检测器和一个紫外线检测器；以及ii)第二个泵通过所述第一个阀门连接到第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到废物收集匣,其中当所述第一个病毒样本在第一个层析柱中运行时，清洗缓冲液在第二个层析柱中运行；c)从所述第一个层析柱洗脱所述第一个病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第一个病毒样本；d)切换所述第一个泵和第二个泵的连接,其中i)所述第一个泵通过所述第一个阀门连接到所述第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述检测系统；以及ii)所述第二个泵通过所述第一个阀门连接到所述第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述废物收集匣；e)将第二个病毒样本注入所述第二个层析柱，并将清洗缓冲液注入所述第一个层析柱；f)从所述第二个层析柱洗脱所述第二个病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第二个病毒样本；以及g)重复步骤(b)至(f)，以量化和分析所述多个病毒样本。2.根据权利要求1的方法，其中所述病毒或病毒颗粒是包膜病毒、无包膜病毒、脱氧核糖核酸病毒、核糖核酸病毒、活病毒、减毒活病毒、灭毒病毒、重组病毒、病毒载体或病毒样颗粒。3.根据权利要求1的方法，其中所述病毒是口蹄疫病毒(FMDV)、牛疱疹病毒-5型(BoHV-5)、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛轮状病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁道夫·塞萨尔·贝林佐尼，尼古拉斯·玛奇，伊曼纽尔·杰拉德·艾蒂安·热古列尔，安娜·罗莫，马塞洛·阿尔诺佛·式必特勒，
申请(专利权)人：生源霸科乌拉圭有限公司，
类型：发明
国别省市：乌拉圭;UY