蛋清处理制造技术

本发明专利技术涉及廉价且有效的制备蛋清(例如，从转基因鸡产下的蛋中获得)的方法，以从蛋清中批量层析分离蛋白质(例如，重组蛋白)。本发明专利技术还涉及过滤酸化的蛋清的方法和从蛋清中分离蛋白质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求在2014年4月23日提交的美国临时申请第61/983,003号案的优先权，在此将其全文并入以供参考。
技术介绍
转基因鸟类(例如，转基因鸡，鹌鹑或者火鸡)是用于获得外源重组蛋白的理想表达系统，所述外源重组蛋白可用于需要大量蛋白质供应的药物或其他的商业应用。一只母鸡每年可以产下多达330只鸡蛋，每只鸡蛋含有6.5g蛋白质。总蛋白质中约3.5g来自蛋清，其中7种不同的蛋白质占90％；卵清蛋白仅占有蛋清蛋白质的2g(约50％的蛋清蛋白质)。目前，已知来源于转基因动物的输卵管特定表达和从所述蛋清中收获的平均外源基因产物为每个鸡蛋约5至10mg。在鸡蛋中生产外源蛋白的优点可包括世代时间短和通过人工授精的繁殖率高。各种蛋白质已经在转基因鸡的鸡蛋中表达。可参阅，例如美国专利号6730822和美国公开号2006/0015960。许多外源治疗性蛋白(例如，人重组蛋白，比如细胞因子(例如，红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(GC-SF)、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、抗体、和人体的溶酶体酶)是制药行业感兴趣的。治疗性蛋白易于从(例如)转基因鸡的蛋清中大量获得。然而，从所述蛋清中分离外源蛋白的传统方法，往往依赖于使用免疫亲和方法或仅适用于小规模生产(比如，包括总蛋清体积至多5L)的其它方法。对于大规模蛋白质生产，基于成本、劳动力和时间这种方法是不实用的。
技术实现思路
本专利技术基于如下意想不到的发现，即：向工业规模(例如，具有至少10L的体积)的蛋清池(例如，从诸如鸡、鹌鹑或者火鸡的转基因鸟所下的蛋中获得)中加入少量的酸性缓冲液(例如，单次大剂量注射(inasinglebolusinjection))，可以制备蛋清用于重组蛋白的批量层析分离，所述重组蛋白如无需稀释蛋清的来自蛋清的人治疗性蛋白。这种方法可以显著地减少需要经过下游分离/纯化过程的蛋清物质的量(例如，在层析分离中使用的柱的数量)，从而显著地减少了从蛋清中分离重组蛋白的成本、劳动力和时间。因此，本专利技术中描述的方法可以极大地提高蛋清制备的效率，从而用于大的、工业规模的治疗性蛋白生产。一方面，本专利技术的特征在于一种制备用于批量层析处理的蛋清的方法，包括以下步骤：(1)将含有酸化剂的酸性缓冲液加入到蛋清池中，每千克蛋清中所述酸性缓冲液的质量分数约0.5wt％至约5wt％；和(2)将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合，以形成pH约5至约6.5的混合蛋清。另一方面，本专利技术的特征在于一种从蛋清中分离重组蛋白的方法，包括以下步骤：(1)提供含有重组蛋白的蛋清池，所述蛋清池的体积至少10L；(2)调节所述蛋清的pH至约5至约6.5，其中所述pH已调节的蛋清的电导率为约8mS/cm至约20mS/cm；(3)过滤所述蛋清以形成溶液(即，清液)；和(4)通过柱层析从蛋清中分离重组蛋白。再一方面，本专利技术的特征在于一种过滤酸化的蛋清的方法，包括以下步骤：(1)使电导率在约8mS/cm和约20mS/cm之间的预处理缓冲液通过过滤器；和(2)使pH为约5至约6.5的蛋清通过所述过滤器得到过滤的蛋清。具体实施方案可以包括一个或者多个下述特征。所述酸化剂选自由乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、高氯酸、柠檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸构成的组。所述酸性缓冲液可以进一步包括约5M至约6M(例如，约5.7M)的醋酸钠。每千克蛋清中，所述酸性缓冲液的质量分数为约0.5wt％-约2wt％(例如，约0.7wt％-约1.5wt％、约0.9wt％-约1.4wt％、或约1.2wt％-约1.3wt％)。所述酸性缓冲液的pH值为约4至约6.5(例如，约4、约4.5、约5、约5.5、约6.0或者约6.5)。在将所述酸性缓冲液与所述蛋清混合之后，所述混合的蛋清的pH可以是约5至约6.5。在一些实施方案中，所述混合的蛋清的pH是约5至约6.3(例如，约5.7至约6.3、约5.8至约6.2、约5.9至约6.1、或者约6)。在一些实施方案中，所述混合的蛋清的pH是使所述混合的蛋清粘度最低的值。所述蛋清可以混合至少约1h和/或在约2℃至约25℃的温度下混合。所述蛋清池的体积至少约10L(例如，至少约50L)。可以单次大剂量注射和/或至少约1L/min的速率将所述酸性缓冲液加入到所述蛋清池中。向所述蛋清池中加入所述酸性缓冲液和混合所述蛋清可以同时进行。所述方法可以进一步包括允许所述混合的蛋清沉降的步骤，以使所述蛋清分离成上层、中间层和下层。在这样的实施方案中，所述方法可以进一步包括分离所述中间层的步骤。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在分离步骤之后过滤所述中间层。所述过滤可以包括使所述中间层的至少一部分(例如，全部)通过平均孔径在约0.1μm至约100μm的过滤器。在一些实施方案中，所述过滤可以包括使所述中间层的至少一部分通过多个过滤器。所述方法进一步包括过滤所述混合的蛋清，而不允许所述混合的蛋清沉降。在这样的实施方案中，所述过滤步骤可以包括通过平均孔径为约0.1μm至约100μm的过滤器过滤所述混合的蛋清。在一些实施方案中，在初始过滤所述混合的蛋清后，所述过滤步骤可以包括1个或者多个后续过滤步骤，所述一个或者多个后续过滤步骤使用平均孔径为约0.1μm至约40μm的一个或者多个过滤器。所述方法进一步包括在混合步骤之后的离心分离步骤，其中将所述混合的蛋清离心，以将含有卵粘蛋白(ovomucin)-溶菌酶复合物的沉淀物与上清液分离。所述蛋清可以包括对蛋清外源的重组治疗性蛋白。所述酸性缓冲液的电导率可以是约8mS/cm至约40mS/cm。在每千克所述蛋清中所述酸性缓冲液的质量分数为约0.5wt％至约5wt％。预处理缓冲液可以用于准备用于滤过酸化的蛋清的过滤器。所述预处理缓冲液可以具有与所述蛋清的pH基本相似或者相同的pH，范围是约5.0至约6.5。例如，所述预处理缓冲液的pH可为约5.9至约6.1(例如，约6)。所述预处理缓冲液可以包括磷酸钠和氯化钠。所述预处理缓冲液的电导率可为约10mS/cm至约20mS/cm。所述酸化的蛋清的电导率可为约8mS/cm至约20mS/cm。所述过滤器的过滤介质面积可为至少约8m2。所述过滤器的平均孔径可为约0.1μm至约100μm。所述蛋清可以在压力差小于约30psi(例如，小于约15psi)时通过所述过滤器。所述实施方案具有以下优点。通常，用于从蛋清中分离/纯化外源蛋白质的层析柱是非常昂贵的，这可能是在商业和工业规模生产来自蛋清中的重组蛋白的关键限制因素之一。因为仅使用少量的酸性缓冲液来获得酸化的蛋清，用于获得纯化的治疗性蛋白的所述酸化的蛋清的量显著减少(即，比常规稀释法少至少3-4倍)。因此，随后将所述酸化的蛋清装到柱子中消耗的时间也明显减少，这允许在工业过程中快速生产蛋白质。此外，因为在所述蛋清制备和分离/纯化过程中，一些治疗性蛋白对所暴露的环境敏感，通过减少样品体积使在制备和分离/纯化过程中花费的时间最小化，对通常涉及蛋清体积为500L或者更多的商业生产是非常有利的。总之，通过使用本文所述的方法，可以极大地使处理的时间、材料、劳力降低到最小。从说明书和附图以及从权利要求中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备用于批量层析处理的蛋清的方法，所述方法包括以下步骤：将含有酸化剂的酸性缓冲液加入到蛋清池中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的约0.5wt％至约5wt％；和将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合以形成pH约5至约6.5的混合的蛋清。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.23 US 61/983,0031.一种制备用于批量层析处理的蛋清的方法，所述方法包括以下步骤：将含有酸化剂的酸性缓冲液加入到蛋清池中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的约0.5wt％至约5wt％；和将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合以形成pH约5至约6.5的混合的蛋清。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸化剂选自由乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、高氯酸、柠檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸组成的组。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述酸性缓冲液进一步含有约5M至约6M的醋酸钠。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酸性缓冲液含有约5.7M的醋酸钠。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的约0.5wt％至约2wt％。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的约0.7wt％至约1.5wt％。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的约0.9wt％至约1.4wt％。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸性缓冲液具有约4至约6.5的pH。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述酸性缓冲液具有约4的pH。10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述酸性缓冲液具有约4.5的pH。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为约5至约6.3。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为约5.7至约6.3。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为约5.8至约6.2。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为约5.9至约6.1。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为约6。16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH是使所述混合的蛋清的粘度最低的值。17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋清混合至少约1小时。18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋清在约2℃至约25℃的温度下混合。19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋清池的体积至少约10升。20.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述酸性缓冲液单次大剂量注射入所述蛋清池。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述酸性缓冲液以至少约1L/min的速率加入。22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸性缓冲液的加入和所述蛋清的混合同时进行。23.根据权利要求1所述的方法，进一步包括允许所述混合的蛋清沉降的步骤，以使所述蛋清分离成上层、中间层和下层。24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括分离所述中间层的步骤。25.根据权利要求24所述的方法，进一步包括在所述分离步骤之后过滤所述中间层。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述过滤包括使所述中间层的至少一部分通过平均孔径为约0.1μm至约100μm的过滤器。27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述过滤包括使所述中间层的至少一部分通过多个过滤器。28.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，M·C·莱维特，M·泰特斯，
申请(专利权)人：阿雷克森制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US