ASX特异性蛋白质连接酶制造技术

本发明专利技术针对具有Asx特异性连接酶和环化酶活性的酶，并且针对编码那些酶的核酸以及所述酶的生产方法。进一步涵盖的是这些酶的方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求于2014年4月24日提交的美国临时专利申请号61/983,729的优先权权益，出于所有目的将该临时申请的内容通过引用以其全部内容并入本文。技术领城本专利技术属于酶技术的
，并且具体地涉及新颖的具有Asx特异性连接酶和环化酶活性的酶，并且涉及编码那些酶的核酸以及生产所述酶的方法。进一步涵盖的是这些酶的方法和用途。
技术介绍
肽和蛋白质的头至尾大环化已经被用作约束结构和增强抗蛋白水解降解的代谢稳定性的策略。另外，受约束的大环构象还可以改进药理活性和口服生物利用度。尽管大部分肽和蛋白质作为直链被产生，但是在多种多样的生物体中仍天然地存在范围从6至78个残基的环肽。这些环肽通常展示出对热变性和蛋白水解的高度抗性，并且已经在蛋白质工程中激发了新趋势，如通过在细胞因子、组胺素(histatin)、泛素C-末端水解酶、芋螺毒素和缓激肽接枝的大环寡肽(cyclotide)的环化中的近期成功所证明的。此外，环肽已经被用作治疗剂，包括缬氨霉素、短杆菌肽S和环孢霉素。迄今为止，化学方法被典型地用于肽的环化。一种可能的策略是天然化学连接(nativechemicallitigation)。这种方法需要N-末端半胱氨酸和C-末端硫酯，这些要求限制了所述方法对于不含半胱氨酸的肽的应用。此外，化学方法并非总是可行的，尤其是对于大的肽和蛋白质。尽管利用天然存在的环化酶的酶法将是理想的，但是当前仅已知非常少的肽环化酶并且由于各种原因它们未被充分利用。然而，其他酶(如其固有功能并非环化酶的分选酶A和内含肽)已经被成功地应用于多种肽和蛋白质的环化。尽管如此，但是这些酶具有缺点。例如，分选酶A是一种将表面蛋白锚定到细菌细胞壁的转肽酶。它的环化反应通常需要过夜孵育和0.1至1摩尔当量的酶。此外，分选酶A具有五肽识别序列LPXTG，并且在被修饰的蛋白质上留下不必要的标签。内含肽是已经用于大环寡肽、向日葵胰蛋白酶抑制剂、和q-防御素的表达的自催化剪接元件。然而，内含肽介导的环化需要靶蛋白与内含肽结构域的基因融合，该必要条件可以影响蛋白质折叠或溶解性。因此在本领域仍需要用于使肽和蛋白质环化的、克服现有技术的缺陷并且理想地是简单、快速和通用的改进手段。
技术实现思路
本专利技术通过提供新颖的满足以上要求的Asx特异性蛋白质连接酶满足了这个需要。诸位专利技术人已经出人意料地发现，从药用植物蝶豆(Clitoriaternatea)中分离出的这种酶是一种天然存在的环化酶，其在大环寡肽(一个大的植物环肽家族)的合成中被用作加工酶。已经发现这种酶是到目前为止最快的已知连接酶，其催化活性高达542,000M-1s-1。它识别C-末端处的三肽基序Asx-His-Val，并且通过切割分选序列His-Val并将Asx连接到N-末端残基上以形成环形拓扑结构而介导肽主链环化。可以显示所述酶不仅有效地环化大环寡肽前体和大小范围从14至58个残基的多种富半胱氨酸肽，并且还有效地环化不含半胱氨酸的肽和绿色荧光蛋白(GFP)。这使得它在希望使给定肽或蛋白质环化的各种应用中是高度通用且有用的。在第一方面中，本专利技术因此涉及包含如在SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列或由其组成的分离的多肽。由在SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列组成的多肽在本文也被称为“butelase1”。在另一个方面中，本专利技术还涉及编码在本文描述的多肽的核酸分子，以及含有这样的核酸的载体，特别是拷贝载体或表达载体。在再一个方面中，本专利技术还针对含有如本文所考虑的核酸或如本文所考虑的载体的宿主细胞，优选非人类宿主细胞。本专利技术的仍再一个方面是用于生产本文所述的多肽的方法，所述方法包括培养本文所考虑的宿主细胞；并且从培养基或从宿主细胞中分离多肽。在仍再一个方面中，本专利技术涉及在本文描述的多肽用于蛋白质连接，特别是用于环化一种或多种肽的用途。本专利技术的另一个方面针对以下多肽用于连接至少两种肽或使肽环化的用途，所述多肽包含以下项或由其组成：(i)如在SEQIDNo:3-109中列出的任一个氨基酸序列；(ii)在其整个长度上与(i)的任一个氨基酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列同一性的氨基酸序列；(iii)在其整个长度上与(i)的任一个氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％序列同源性的氨基酸序列；或(iv)(i)-(iii)中任一项的片段。在仍另一个方面中，本专利技术涉及用于使肽环化的方法，该方法包括结合本专利技术的用途，在允许环化所述肽的条件下用上文描述的多肽孵育所述肽。在仍再一个方面中，本专利技术涉及用于连接至少两种肽的方法，该方法包括结合本专利技术的用途，在允许连接所述肽的条件下用上文描述的多肽孵育所述肽。在另一个方面中，本专利技术涉及本专利技术的分离的多肽被固定到其上的固体支持材料及其用途和使用此类底物的方法。在另一个方面中，本专利技术还涵盖包含编码本文所述的具有蛋白质连接酶和/或环化酶活性的多肽的核酸分子的转基因植物。多肽优选地不天然地存在于所述植物中。因此，本专利技术还重点包括表达根据本专利技术的异源多肽的转基因植物。附图说明图1示出了kB1-NHV的氧化折叠。使所述肽在含有50％乙腈、100mM碳酸氢铵、3mM还原型谷胱甘肽的缓冲液(pH8.0)中在30μM浓度下折叠18h。折叠的肽最后在RP-HPLC中洗脱。图2示出了肽环化酶活性的MS表征。(a)由butelase1介导的kB1-NHV环化的示意图。对butelase1识别位点处的残基(P1、P1'和P2’)进行了标记。(b,c)分别由蝶豆(C.Ternatea)粗提物和纯化的butelase1介导的kB1-NHV环化的MS曲线。括号中的肽是cliotide，蝶豆中天然存在的大环寡肽。产物环状kB1由箭头指示。(d)刀豆豆荚蛋白(Jackbeanlegumain)被用作对照。MS曲线显示刀豆豆荚蛋白水解kB1-NHV中的天冬酰胺酰基键，以给出线性形式的kB1。用K+或K2+标记的峰分别是对应于一个或两个钾离子的结合的离子加合物。图3示出了酶环化的kB1和天然肽的共洗脱。(a)酶环化的kB1的HPLC曲线。(b)从O.affinis中提取的天然kB1的HPLC曲线。(c)酶环化的和天然的kB1的共洗脱曲线。图4示出了从butelase1对kB1-NHV的转化获得的酶环化的kB1中的环状主链的MS证据。(a)S-脲甲基化之后环化的kB1的MS曲线。环化的kB1具有2891的m/z值，所述值在S-烷基化之后变为3239。在3182处观察到不完全烷基化造成的次峰，其中仅有5个半胱氨酸被修饰。(b)胰蛋白酶消化之后S-烷基化的kB1的MS曲线。观察到18Da的质量增加，这指示水分子和环状主链的加入。(c)3257-Da胰蛋白酶片段的MS/MS曲线。肽序列示出在MS/MS谱的顶端。y-离子被标记在对应峰的顶端。图5示出了酶环化的kB1(深灰色)和天然kB1(浅灰色)的1DNMR谱比较。将肽溶解于pH4.3的95％H2O/5％D2O中。在298K下记录谱。图6示出了butelase1的分离、表征和同源建模。(a)纯化的butelase1的SDS-PAGE分析。通过银染将蛋白质可视化。左泳道是纯化的butelase本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有蛋白质连接酶、优选环化酶活性的分离的多肽，包含以下项或由其组成(i)如在SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列；(ii)在其整个长度上与在SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列同一性的氨基酸序列；(iii)在其整个长度上与在SEQ ID No:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％序列同源性的氨基酸序列；或(iv)(i)‑(iii)中任一项的片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.24 US 61/983,7291.具有蛋白质连接酶、优选环化酶活性的分离的多肽，包含以下项或由其组成(i)如在SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列；(ii)在其整个长度上与在SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列同一性的氨基酸序列；(iii)在其整个长度上与在SEQIDNo:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％序列同源性的氨基酸序列；或(iv)(i)-(iii)中任一项的片段。2.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含SEQIDNO:2中列出的氨基酸序列或由其组成。3.如权利要求1或2所述的分离的多肽，其中所述多肽包含(i)对应于SEQIDNO:1的位置19的位置处的氨基酸残基N；和/或(ii)对应于SEQIDNO:1的位置124的位置处的氨基酸残基H；和/或(iii)对应于SEQIDNO:1的位置166的位置处的氨基酸残基Cat。4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽能以80％或更高、优选90％或更高的效率环化给定肽。5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽能以(i)500μM或更小、优选250μM或更小的Km；和/或(ii)至少0.05s-1、优选至少0.5s-1、更优选至少1.0s-1、最优选至少1.5s-1的kcat环化给定肽。6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽被糖基化。7.编码根据权利要求1至6中任一项所述的多肽的核酸分子。8.如权利要求7所述的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在载体中。9.如权利要求8所述的核酸分子，其中所述载体进一步包含用于控制所述核酸分子的表达的调节元件。10.包含如权利要求7至9中任一项所述的核酸分子的宿主细胞。11.用于产生如权利要求1至6中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在允许表达所述多肽的条件下培养根据权利要求9所述的宿主细胞，并且从所述宿主细胞或培养基中分离所述多肽。12.具有环化酶活性的多肽用于使肽环化的用途，具有环化酶活性的所述多肽是如权利要求1至6中任一项所述的分离的多肽或包含以下项或由其组成(i)如在SEQIDNo:3-109中列出的任一个氨基酸序列；(ii)在其整个长度上与(i)的任一个氨基酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列同一性的氨基酸序列；(iii)在其整个长度上与(i)的任一个氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％序列同源性的氨基酸序列；或(iv)(i)-(iii)中任一项的片段。13.如权利要求12所述的用途，其中待环化的所述肽包含(i)氨基酸序列(X)oN/D(X)p，优选地在C-末端，其中X是任何氨基酸并且o和p彼此独立地是至少2的整数，优选氨基酸序列(X)oNHV；或(ii)C-末端氨基酸序列(X)oN*/D*，其中X是任何氨基酸，o是至少2的整数，并且所述C-末端N/D残基被酰胺化，具体地说，C-末端羧基基团、在D的情况下优选α-羧基基团，被具有化学式–C(O)-N(R’)2的酰胺基置换，其中R’是任何残基。14.如权利要求12或13所述的用途，其中待环化的所述肽包含N-末端氨基酸序列X1X2(X)q，其中X可以是任何氨基酸；X1可以是除Pro外的任何氨基酸；X2可以是任何氨基酸，但是优选地是疏水性氨基酸，更优选Val、Ile或Leu；并且q是0或者1或更大的整数。15.如权利要求12至14中任一项所述的用途，其中待环化的所述肽是环状胱氨酸结多肽、环肽毒素、环状抗微生物肽、环状组胺素、或人类或动物环肽激素的线性前体形式。16.如权利要求12至15中任一项所述的用途，其中待环化的所述肽的长度是10个或更多个氨基酸。17.如权利要求12至16中任一项所述的用途，其中待环化的所述肽包含以下项或由其组成(i)在SEQIDNo:110-116和128-132的任一项中列出的氨基酸；或(ii)氨基酸序列(X)nC(X)nC(X)nC(X)nC(X)nC(X)nC(X)nNHV(X)n,，其中每个n是独立地选自1至6的整数并且X可以是任何氨基酸。18.具有蛋白质连接酶活性的多肽用于连接至少两种肽的用途，具有蛋白质连接酶活性的所述多肽是如权利要求1至6中任一项所述的分离的多肽或包含以下项或由其组成(i)如在SEQIDNo:3-109中列出的任一个氨基酸序列；(ii)在其整个长度上与(i)的任一个氨基酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列同一性的氨基酸序列；(iii)在其整个长度上与(i)的任一个氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％序列同源性的氨基酸序列；或(i...

【专利技术属性】
技术研发人员：基恩·特鲁茨·江·阮，谈秉军，
申请(专利权)人：南洋理工大学，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG