一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向骨细胞分化的方法技术

本发明专利技术涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向骨细胞分化的方法。本发明专利技术提供的培养液中包括基础培养液、维生素C、地塞米松、β‑甘油磷酸钠、IGF‑1、BMP‑2、PRP和FBS。本发明专利技术提供的培养液能够作为骨骼肌干细胞成骨分化的诱导培养液。提高了骨骼肌干细胞向骨细胞分化的数量并缩短分化的时间。实验表明，以本发明专利技术提供的培养液诱导骨骼肌干细胞，能够在7d内即出现骨细胞的特性，14d细胞形态发生改变且茜素红染色细胞数目增多。诱导21天后，细胞中OPN和Col‑I基因的表达量增加，且显著(p<0.05)高于对比例中的OPN和Col‑I基因的表达量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向骨细胞分化的方法。
技术介绍
骨骼移植(植骨)是治疗骨缺损、骨折不连接和进行脊柱融合术的必需手段。传统植骨材料为自体骨骼、异体骨骼和人工骨材料，这些中除自体松质骨有少许成骨细胞外，均只能提供充填和支架作用；需肌体将其逐步吸收、成骨替代，过程缓慢，再出现骨不连、骨缺损或脊椎间假关节发生率高，影响了植骨效果。近年来组织工程技术的迅猛发展，为解决传统植骨术后骨形成缓慢和新骨形成不良等技术难点提供了一种有效解决途径。骨组织工程技术主要包括成骨支架、成骨细胞和调控成骨分化的细胞因子三个方面。目前研究表明，各类已发现的间充质干细胞等干细胞的研究和应用从很大程度上解决了骨组织工程人工骨的种子细胞来源问题。进而，如何促进细胞的增殖和成骨分化成为组织工程技术的关键环节和研究热点。骨骼肌源性干细胞(muscle-derivedstemcells)是成年动物或人肌肉组织中特有的干细做为中胚层起源的一种成体间充质干细胞，具有自我更新能力和多项分化的潜能，可在体外分化为血细胞、骨细胞、内皮细胞、神经细胞等系的细胞。骨骼肌干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，骨骼肌干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。目前，对于MDSCs成骨分化诱导的研究主要集中于不同细胞因子对其生物学行为产生的不同影响，其诱导效果并不理想。因此，进一步开发MDSCs成骨分化的方法，能够进一步促进骨骼移植技术的发展。专利技术内容有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向骨细胞分化的方法，本专利技术提供的细胞培养液能够促进骨骼肌干细胞向骨细胞分化，其分化周期短，分化效率高。本专利技术提供的细胞培养液，包括基础培养液、维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、IGF-1、BMP-2、PRP和FBS。胎牛血清(fetalcalfserum，简称FBS)是血清中的一种，能够提供维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。富血小板血浆(PRP)是血液经过离心得到的血小板浓缩物，富含各种生长因子，经激活后释放大量的生长因子，如血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等。这些生长因子已被证实，在单独应用或联合应用时能刺激细胞增殖、分化，对软组织和骨组织的愈合有促进作用。骨成形蛋白(BMP)能诱导机体内的间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨细胞。将BMP植入软组织内，可异位诱导新骨的形成。类胰岛素一号增长因子(IGF-1)也被称作“促生长因子”，对维持与细胞分化有关蛋白质水平十分重要，与一些生长因子合用能促进细胞分化成熟。维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠是目前干细胞成骨诱导或称软骨诱导液中常见组分，其中，地塞米松通过促进CbfalmRNA和OsterixmRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。β-甘油磷酸钠可以为成骨细胞提供磷酸离子，同时促进生理性钙盐的沉积和钙化，是骨髓基质干细胞产生矿化结节的必要条件。维生素C(抗坏血酸)在体外能增加钙盐的沉积，促进矿化结节的形成，并通过间充质细胞间接调节破骨细胞的分化。本专利技术以维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、IGF-1、BMP-2、PRP、FBS添加入基础培养基，作为骨骼肌干细胞成骨分化的诱导培养液。提高了骨骼肌干细胞向骨细胞分化的数量并缩短分化的时间。实验表明，以本专利技术提供的培养液诱导骨骼肌干细胞，能够在7d内即出现骨细胞的特性，细胞形态发生改变且茜素红染色细胞数目增多。诱导21天后，细胞中OPN和Col-I基因的表达量增加，且显著(p<0.05)高于对比例中的OPN和Col-I基因的表达量。在本专利技术的实施例中，PRP的体积分数为8％～12％；FBS的体积分数为8％～12％。在一些实施例中，PRP的体积分数为10％；FBS的体积分数为10％。在一些实施例中，PRP的体积分数为12％；FBS的体积分数为8％。在一些实施例中，PRP的体积分数为8％；FBS的体积分数为12％。在本专利技术的实施例中，IGF-1的浓度为20μg/L～30μg/L；BMP-2的浓度为80μg/L～120μg/L。在一些实施例中，IGF-1的浓度为20μg/L；BMP-2的浓度为120μg/L。在一些实施例中，IGF-1的浓度为30μg/L；BMP-2的浓度为80μg/L。在一些实施例中，IGF-1的浓度为25μg/L；BMP-2的浓度为100μg/L。在本专利技术的实施例中，维生素C的浓度为40μg/L～60μg/L；地塞米松的浓度为1×10-7mol/L～1×10-9mol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为8mol/L～12mol/L。在一些实施例中，维生素C的浓度为40μg/L；地塞米松的浓度为1×10-7mol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为12mol/L。在一些实施例中，维生素C的浓度为60μg/L；地塞米松的浓度为1×10-9mol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为8mol/L；在一些实施例中，维生素C的浓度为50μg/L；地塞米松的浓度为1×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为10mol/L；在一些实施例中，维生素C的浓度为50μg/L；地塞米松的浓度为1×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为10mol/L；IGF-1的浓度为25μg/L；BMP-2的浓度为100μg/L。在一些实施例中，维生素C的浓度为40μg/L；地塞米松的浓度为1×10-7mol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为12mol/L；IGF-1的浓度为20μg/L；BMP-2的浓度为120μg/L。在一些实施例中，维生素C的浓度为50μg/L；地塞米松的浓度为1×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为10mol/L；IGF-1的浓度为25μg/L；BMP-2的浓度为100μg/L；PRP的体积分数为10％；FBS的体积分数为10％。在本专利技术的实施例中，基础培养液为DMEM/F12无血清培养液。本专利技术所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本专利技术对此不做限定，其实施皆在本专利技术的保护范围之内。本专利技术采用的人干细胞无血清培养基为DMEM/F12无血清培养液。本专利技术提供的培养液中不含有抗生素，而是通过更加适宜的培养条件，促进骨骼肌干细胞向骨细胞的分化，增强目标细胞的生长势，降低感染风险。本专利技术提供的培养液能够诱导骨骼肌细胞相骨细胞的分化，分化效率高，速度快。实验表明，诱导培养14d后，碱性磷酸酶活性增高，成骨细胞标志性基因OPN、Col-I表达量增高，茜素红染色细胞数量增多。本专利技术提供的细胞培养液在诱导骨骼肌干细胞向骨细胞分化中的应用。本专利技术还提供了一种诱导骨骼肌干细胞向骨细胞分化的方法，骨骼肌干细胞以基础培养基培养至70％～80％融合后以本专利技术提供的细胞培养液诱导。在本专利技术的实施例中，诱导的时间为7d～21d。在本专利技术的实施例中，骨骼肌干细胞为3～5代的骨骼肌干细胞。一些实施例中，骨骼肌干细胞为第3代的骨骼肌干细胞。本专利技术中，骨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养液，其特征在于，包括基础培养液、维生素C、地塞米松、β‑甘油磷酸钠、IGF‑1、BMP‑2、PRP和FBS。

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养液，其特征在于，包括基础培养液、维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、IGF-1、BMP-2、PRP和FBS。2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述IGF-1的浓度为20μg/L～30μg/L；所述BMP-2的浓度为80μg/L～120μg/L。3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述PRP的体积分数为8％～12％；FBS的体积分数为8％～12％。4.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述维生素C的浓度为40μg/L～60μg/L；所述地塞米松的浓度为1×10-7mol/L～1×10-9mol/L；所述β-甘油磷酸钠的浓度为8mol/L～12mol/L。5.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述维生素C的浓度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，戚康艺，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44