一种促进间充质干细胞半月板分化的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进间充质干细胞半月板分化的方法，包括以下步骤：a）取人体半月板，在无菌条件下用PBS缓冲液对人体半月板进行洗涤，将洗涤后的半月板切成半月板小块，用四型梭菌属的胶原酶溶解；b）使用添加有青霉素‑链霉素‑谷氨酸盐的DMEM对溶解后获得的细胞进行洗涤，将分离出的半月板细胞接种培养；c）取人体的间充质干细胞，在间充质干细胞生长培养基中进行培养；d）将培养好的半月板细胞与间充质干细胞按一定细胞数目比进行混合培养，将混合培养所得的细胞团块离心，离心后置于圆锥管内静置培养。本明提供的促进间充质干细胞半月板分化方法无需专门的仪器设备，只要掌握细胞培养的基本操作规则即可，具有简便易行的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞组织工程
，具体涉及一种促进间充质干细胞半月板分化的方法。
技术介绍
半月板是两个月牙形的纤维软骨，位于胫骨平台内侧和外侧的关节面，它在人体中起着重要的作用：稳定膝关节，传布膝关节负荷力，促进关节内营养等。正是由于半月板所起到的稳定载荷作用，才保证了膝关节长年负重运动而不致损伤。半月板损伤是最常见的膝关节损伤，大多数的半月板损伤都发生在内区域，由于脉管系统的缺乏和细胞浓度低导致其难以治愈。对缺陷的半月板进行局部或完全的半月板切除术是一种常见的临床治疗方法。然而，这种手术将增加对膝部关节软骨的机械应力达到350%以上，最终会导致软骨退化、关节间隙变狭窄和关节炎。半月板的组织工程学为局部和完全的半月板缺陷提供了一个新的解决方案，对于替代整个半月板或者用自体的半月板细胞修复半月板损伤很有希望，而得到可供选择的细胞源是半月板组织工程学的关键。一个细胞来源是间充质干细胞，间充质干细胞通过分泌各式各样的细胞因子和生长因子来抑制细胞凋亡，通过旁分泌、自分泌和抑制自身的免疫系统刺激细胞分化，这就使同种异体的间充质干细胞在半月板重建中能作为自体的间充质干细胞，而共同培养间充质干细胞和成熟的半月板细胞在半月板组织工程学上是可行的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种可以修复半月板损伤的促进间充质干细胞半月板分化的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种促进间充质干细胞半月板分化的方法，其创新点在于：包括以下步骤：a）取人体半月板，在无菌条件下用PBS缓冲液对人体半月板进行洗涤，将洗涤后的半月板切成半月板小块，用四型梭菌属的胶原酶溶解；b）使用添加有青霉素-链霉素-谷氨酸盐的DMEM对溶解后获得的细胞进行洗涤，将分离出的半月板细胞接种培养；c）取人体的间充质干细胞，在间充质干细胞生长培养基中进行培养；d）将培养好的半月板细胞与间充质干细胞按一定细胞数目比进行混合培养，将混合培养所得的细胞团块离心，离心后置于圆锥管内静置培养，将静置培养形成的细胞球从圆锥管底部分离，在无菌条件下将细胞球转至超低附平板中培养，收获细胞微球。进一步的，所述步骤a)中，人体半月板切成半月板小块的具体步骤包括：首先，去除滑膜组织；然后，将人体半月板切成1cm3的半月板小块。进一步的，所述步骤a)中胶原酶溶解的具体步骤包括：先将半月板小块放入含5%（v/v）胎牛血清的DMEM中，然后，使用的浓度为2mg/ml的四型梭菌属的胶原酶进行溶解。进一步的，所述步骤b）中，使用添加有青霉素-链霉素-谷氨酸盐的DMEM进行洗涤的洗涤次数为3次；洗涤后，细胞活性为95%；所述半月板细胞接种培养的培养容器为T175组织培养瓶，每瓶T175组织培养瓶可接种500万个细胞；对半月板细胞进行贴壁单层培养，直至细胞数量达到T175组织培养瓶可接种总量的80-90%。进一步的，所述步骤b）中培养基为添加了10%（v/v）小牛血清的DMEM，培养温度为37℃，培养环境为含有5%(v/v)CO2的潮湿空气，培养基每4天更换一次。进一步的，所述步骤c）中培养温度为37℃，培养环境为含有5%(v/v)CO2的潮湿空气。进一步的，所述步骤d）中静置培养时间为2-3天；所述细胞球在超低附平板中培养时间21天，培养基每周更换三次。进一步的，所述步骤d）中，所述半月板细胞与间充质干细胞最佳的共培养比例为75:25。本专利技术的有益效果如下：（1）本明提供的促进间充质干细胞半月板分化方法无需专门的仪器设备，只要掌握细胞培养的基本操作规则即可，具有简便易行的特点。（2）本专利技术中在适当的组合条件下共培养半月板细胞和间充质干细胞表现出最高水平的I型胶原蛋白、糖胺聚糖的产生以及最低的肥大基因表达，即促进了间充质干细胞的半月板分化。（3）本专利技术操作简单、可重复性强，为最终实现组织器官的再生和替换提供可能，并藉此希望找到一条大规模生产所需细胞平台的途径，进而为发育生物学、医学、组织工程学领域等开拓一个崭新的研究前景。附图说明图1为本专利技术中细胞微球的Ⅰ型胶原/DNA含量。图2为本专利技术中细胞微球的Ⅱ型胶原/DNA含量。图3为本专利技术中细胞微球的GAG/DNA含量。图4为本专利技术中细胞微球重量。图5为本专利技术中细胞微球的Ⅰ型胶原表达结果。图6为本专利技术中细胞微球的Ⅱ型胶原表达结果。图7为本专利技术中细胞微球的ACAN基因表达结果。图8为本专利技术中细胞微球的COMP基因表达结果。图9为本专利技术中细胞微球的X型胶原表达结果。图10为本专利技术中细胞微球的MMP13基因表达结果。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。一种促进间充质干细胞半月板分化的方法，包括下列步骤：（1）人体半月板细胞的制备：从无关节疾病史的成人志愿者的尸体中，死亡时间在22-72h内获得人体半月板。在无菌条件下，将获得的人体半月板用无菌的PBS冲洗，去除人体半月板上的滑膜组织，然后将人体半月板切成1立方厘米的小块，放入含5%（v/v）胎牛血清的DMEM中，用2mg/ml的四型梭菌属的胶原酶溶解。将溶解后获得的半月板细胞用添加青霉素-链霉素-谷氨酸盐的DMEM洗涤三次，细胞活性为95%。将分离后的半月板细胞接种于T175组织培养瓶中单层培养，每瓶500万个细胞。培养基为添加了10%（v/v）小牛血清的DMEM，培养温度为37℃，培养环境为含有5%(v/v)CO2潮湿空气，培养基每4天更换一次。(2)人体间充质干细胞的制备：取适量人的间充质干细胞，在间充质干细胞生长培养基中培养，培养温度为37℃，培养环境为含有5%(v/v)CO2潮湿空气。(3)细胞微球的形成：将上述步骤（1）所得的半月板细胞和步骤（2）所得的间充质干细胞以一定数目比混合培养构建细胞微球，每个细胞微球由5x105个细胞组成。将混合培养所得的细胞团块以300g的速度离心后，置于圆锥管中静置培养2-3天至细胞球形成并从底部分离。在无菌条件下，将形成的细胞球用移液枪转移至超低附平板中培养21天，培养基每周更换3次，收获细胞微球。实施例1：步骤(3)中，将上述步骤（1）所得的半月板细胞和步骤（2）所得的间充质干细胞以100:0数目比混合培养构建细胞微球。实施例2：步骤（3）中，将上述步骤（1）所得的半月板细胞和步骤（2）所得的间充质干细胞以75:25的数目比混合培养构建细胞微球。实施例3步骤（3）中，将上述步骤（1）所得的半月板细胞和步骤（2）所得的间充质干细胞以50:50的数目比混合培养构建细胞微球。实施例4步骤（3）中，将上述步骤（1）所得的半月板细胞和步骤（2）所得的间充质干细胞以25:75的数目比混合培养构建细胞微球。实施例5步骤（3）中，将上述步骤（1）所得的半月板细胞和步骤（2）所得的间充质干细胞以0:100的数目比混合培养构建细胞微球。为说明半月板细胞、间充质干细胞共培养的效果，对上述实施例1-实施例5所制备的细胞微球进行了多种分析检测：1、共聚焦显微镜观察细胞微球。将制备的细胞微球切片，用激光扫描共聚焦显微镜在合适的荧光通道中成像，观察细胞团块的结构。2、细胞微球的生化试验。通过使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶将制得的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进间充质干细胞半月板分化的方法，其特征在于：包括以下步骤：a）取人体半月板，在无菌条件下用PBS缓冲液对人体半月板进行洗涤，将洗涤后的半月板切成半月板小块，用四型梭菌属的胶原酶溶解；b）使用添加有青霉素‑链霉素‑谷氨酸盐的DMEM对溶解后获得的细胞进行洗涤，将分离出的半月板细胞接种培养；c）取人体的间充质干细胞，在间充质干细胞生长培养基中进行培养；d）将培养好的半月板细胞与间充质干细胞按一定细胞数目比进行混合培养，将混合培养所得的细胞团块离心，离心后置于圆锥管内静置培养，将静置培养形成的细胞球从圆锥管底部分离，在无菌条件下将细胞球转至超低附平板中培养，收获细胞微球。

【技术特征摘要】
1.一种促进间充质干细胞半月板分化的方法，其特征在于：包括以下步骤：a）取人体半月板，在无菌条件下用PBS缓冲液对人体半月板进行洗涤，将洗涤后的半月板切成半月板小块，用四型梭菌属的胶原酶溶解；b）使用添加有青霉素-链霉素-谷氨酸盐的DMEM对溶解后获得的细胞进行洗涤，将分离出的半月板细胞接种培养；c）取人体的间充质干细胞，在间充质干细胞生长培养基中进行培养；d）将培养好的半月板细胞与间充质干细胞按一定细胞数目比进行混合培养，将混合培养所得的细胞团块离心，离心后置于圆锥管内静置培养，将静置培养形成的细胞球从圆锥管底部分离，在无菌条件下将细胞球转至超低附平板中培养，收获细胞微球。2.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞半月板分化的方法，其特征在于：所述步骤a)中，人体半月板切成半月板小块的具体步骤包括：首先，去除滑膜组织；然后，将人体半月板切成1cm3的半月板小块。3.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞半月板分化的方法，其特征在于：所述步骤a)中胶原酶溶解的具体步骤包括：先将半月板小块放入含5%（v/v）胎牛血清的DMEM中，然后，使用的浓度为2mg/ml的四型梭菌属的胶原酶进行溶解。4.根据权利要求1所述的一种促进...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔晓峰，高桂芳，
申请(专利权)人：武汉枫霖科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42