本发明专利技术公开了一个大白菜pol CMS的恢复基因，该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。通过对大白菜不育系和恢复系所提取的DNA进行PCR扩增，之后进行测序比较，发现该基因在两种材料间有多处核苷酸突变，但核苷酸序列长度和编码氨基酸的长度都没有变。根据核苷酸序列突变设计了如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的特异性PCR引物，通过对大白菜中所提取的DNA进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳鉴定，能快速检测到含有该基因的大白菜植株，其检测准确性高，操作简单，成本低廉。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及细胞质遗传、进化和核质互作机制，特别是分子水平上细胞质雄性不育的恢复机理等领域。
技术介绍
PolCMS是甘蓝型油菜（B.napus）中发现的第一个有实用价值的雄性不育类型，后被转育到大白菜(BrassicacampestrisL．ssp．pekinensis)等多种十字花科蔬菜作物中，是目前大白菜育种中应用比较广泛的不育源之一。大白菜杂种优势明显，杂交种是目前主要生产用种。目前生产中应用的杂交种，大多是通过自交不亲和系和雄性不育两用系配制。自交不亲和系存在亲本自交衰退、扩繁困难、制种成本高等缺点，而用雄性不育两用系制种则要拔除50%的可育株，增加了育苗成本，费时费工，降低了制种产量，若拔除不彻底，则会降低种子纯度。利用细胞质雄性不育系进行杂种生产，可大大降低制种成本，避免自交不亲和系和雄性不育两用系的缺点。恢复系是利用细胞质雄性不育系生产油菜杂交种所必不可少的材料。PolCMS转入大白菜后，经过广泛测交，筛选到多个育性恢复材料。本研究利用图位克隆技术定位到一个PolCMS的恢复基因，并根据测序结果开发一个与恢复基因共分离的显性标记，为在大白菜种质资源中筛选恢复材料和分子标记辅助选择育种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个大白菜polCMS的恢复基因，该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。在大白菜中该恢复基因可恢复polCMS的育性，使花药正常发育，产生正常的花粉，其等位基因由于碱基突变而不具仍恢复polCMS育性的功能。这一个大白菜polCMS的恢复基因，具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。所述的基因序列所编码的蛋白质，具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。一对用于检测上述基因的特异性PCR引物，序列为：上游：5’-GGATGCGATCCTGATATTTG-3’下游：5’-AGAGAGAGGCTACAGAACAAACT-3’即SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的序列。检测这一个大白菜polCMS的恢复基因的方法为，采用上述的特异性PCR引物对大白菜叶片所提取的DNA进行PCR扩增反应，能得到416bpDNA序列，如SEQIDNo.5所示。该片段只能在含有polCMS恢复基因的大白菜中能扩增得到，而在不具有恢复能力的大白菜中不能扩增出条带（图1）。在本专利技术研究中，专利技术人设计的特异性PCR引物和检测方法，不仅能对大白菜苗期所提取的DNA进行PCR扩增，还能用于大量筛选大白菜种质资源。该PCR引物是利用引物设计软件Primer5.0，以大白菜polCMS的恢复基因及其等位基因之间的序列差异为基础设计的。根据扩增条带的有无能快速检测到含有此基因的大白菜品种和种质资源，其检测的准确性高，操作简单，成本低廉。若一个大白菜品种或种质资源中含有此恢复基因，则用上述引物能够扩增出长度为416bp的特异性片段，若不含有此恢复基因，则扩增不出任何产物（图1）。含有一个大白菜polCMS的恢复基因的材料92S105（柯桂兰，宋胭脂，赵利民，张鲁刚等.秦白四号大白菜选育.陕西农业科学,1996,No.4，12-15）是经过测交验证，并多代自交育成的各种农艺性状稳定的品系。专利技术人在研究中将此品系与大白菜polCMS的不育系06J45（许小勇,孙希禄,方智远,张鲁刚.大白菜CMS雄性不育发生相关基因的克隆与分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2014,42（12）:119-125）进行杂交，并以06J45为母本用杂交一代回交构建了BC1F1，进一步用杂合单株自交获得BC1S2遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将含有一个大白菜polCMS的恢复基因定位在白菜的第9号染色体上。本专利技术的有益效果为：获得了一个大白菜polCMS的恢复基因及快速检测是否含有该基因的检测方法，并且利用该方法可以快速检测含有该基因的大白菜植株，其检测准确性高，操作简单，成本低廉。使得在大白菜种质资源中大量筛选恢复系成为可能，从而减少大田人工测交和育性调查的工作量。另个通过本专利技术得到的一个大白菜polCMS的恢复基因可用于研究polCMS/Rf系统中核质互作的机理等，并且也可以作为标记性状在大白菜细胞质雄性不育系选育、杂交育种和杂交种的纯度鉴定中得以应用。附图说明图1为本专利技术的特异性PCR引物对该基因进行PCR扩增的结果。F代表含有恢复基因的大白菜PCR扩增产物，S代表不含有恢复基因的大白菜的扩增产物。具体实施方式实施例1白菜基因组总DNA的提取1）取0.2g去掉主脉的白菜新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；2）向离心管中加700μl经65℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH=8.0）：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L），再加入10µL的β-巯基乙醇，迅速混匀；3）随后将离心管放入65℃烘箱中，中间每间隔5-10min分钟摇一次，温浴45min；4）取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，摇匀15min后，常温下10000r/min离心10min；5）将上层液相（约700μl）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液（氯仿：异戊醇＝24：1），轻轻摇匀10min，常温下10000r/min离心10min；6）取上清（约500μl），加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下8000r/min离心5min；7）弃上清，加入500μl质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；8）加入500μl的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29μl的RNaseA（10µg/µl），混匀后稍离心，37℃保温30min；9）加入3mol/L的NaAc溶液50µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；10）在4℃条件下，8000r/min离心5min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400µl～500µl的灭菌ddH2O溶解使用。实施例2PCR扩增和基因检测（一）分别获得大白菜polCMS的恢复基因及其在不育系中的等位基因1）20μlPCR反应体系为：50ng/μl的模板DNA为2μl，2×TaqMasterMix10μl，10μM的上、下游引物各1μl，用无菌去离子水补充反应体系至20μl。引物序列为：上游：5’-GTTCTCTCTCTCCCACAAAGATT-3’下游：5’-TTAAGCCCAAGTACCTCAGAAAC-3’2）PCR扩增反应在PCR仪上进行温度和反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物长度为2196bp，恢复系大白菜中该基因测序结果如SEQIDNo.6，不育系大白菜中该基因测序结果如SEQIDNo.7。使用DNAStar软件包中的EditSeq软件获得该基因的ORF序列、并本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个大白菜pol CMS的恢复基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一个大白菜polCMS的恢复基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的一个大白菜polCMS的恢复基因，其特征在于：所述的基因序列所编码的蛋白质为SEQIDNo.2所示的650个氨基酸序列。3.一对用于检测权利要求1所述的一个大白菜polCMS的恢复基因的特异性PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列为：上游：5’-GGATGCGATCCTGATATTTG-3’下游：5’-AGAGAGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：张鲁刚，张华敏，吴俊清，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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