本发明专利技术提供一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒包含有6条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。本发明专利技术的试剂盒在不延长原有1小时反应时间的条件下，实现了将荧光染料直接加入反应管的一步操作，不仅简化了操作程序，解决了含有钙黄素的预混染料对Bst DNA扩增酶的抑制而导致在反应管直接加入荧光染料不显色的根本问题，还有效避免了由于反应结束后二次开盖导致的释放产物形成气溶胶的污染发生。应用本发明专利技术的试剂盒进行检测，能够肉眼直接直观判断，具有良好的特异性、敏感性和稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒。
技术介绍
猪细小病毒porcineparvovirus(PPV)会导致母猪和育肥猪的繁殖障碍，是给猪场带来严重经济损失的最常见的猪繁殖障碍性病毒之一，目前仍然在我国猪场广泛流行。由于我国大部分猪场，尤其是大规模养殖场，广泛采用PPV型灭活疫苗接种猪只，使得采用ELISA等血清学方法基本无法区分感染和免疫。所以，普查或者诊断PPV的感染主要依赖于基于检测核酸存在的各种诊断方法。常见的PPV核酸诊断方法包括常规PCR、实时定量PCR和原位杂交，这些方法由于受特殊仪器和对操作人员高水平要求的限制，主要在各种实验室使用。目前，针对PPV感染的猪场现场诊断方法还在研制中，没有相应的商品化产品问世。本申请人在2009年建立了针对PPV型的LAMP诊断方法（Chenetal,2009)，该方法针对VP2基因设计了4条特异性引物，扩增产物可以采用在琼脂糖凝胶电泳形成的典型梯形条带检测，也可以在反应结束后，打开反应管盖子加入SYBRGreen或者含有钙黄素和锰离子的预混荧光染料，根据反应管颜色的变化，判断待检样品的PPV感染的有无。添加SYBRGreen染料后阳性反应管可形成棕色颜色，能够肉眼观察识别，但是棕色不如加入钙黄素预混染料形成的明亮绿色易于观察。含钙黄素的荧光染料会在一定程度上抑制Bst聚合酶，所以，在反应管直接加入这些染料，会导致扩增产物量下降，在琼脂糖凝胶电泳上很难形成典型的梯形条带，也很难观察到反应管荧光的改变。在反应结束后再加入荧光染料进行观察判断的二步法，不仅操作繁琐，更主要的问题是在打开反应管盖子时，扩增产物被释放到空气中，形成了大量的气溶胶，再次进行LAMP检测时，假阳性率就会大大增加。为了简化操作步骤，最大可能性地降低假阳性率，满足猪场现场检测以及广大养殖业者能够自行诊断的需求，需要进一步进行改进。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒包括提供用于检测猪细小病毒的特异性LAMP引物组，共六条引物。本专利技术提供用于检测猪细小病毒的特异性LAMP引物组，所述引物组为以下六条引物：F3：5'-gCACACgCATCAAgACTCATAC-3'，B3：5'-TggTggTgAggTTgCTgATTC-3'，FIP：5'-gCATCgTCTTgTACCATTTgTCCCTgCCAgAACACgAAACATACAA-3'，BIP：5'-CCTTggTCACTAATAgATgCTAACgCAgTTTATTTCTgTCATgTTgTTggA-3'，FLoop：5'-TAAATTCAgAATCAggggTggC-3'，BLoop：5'-gCCAgTCCgCTggATTgAA-3'。本专利技术还提供一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。作为优选，还包括含有钙黄素和锰离子的荧光染料。作为优选，所述荧光染料的用量为在25μL检测体系中含有0.4-1.0μL。作为优选，所述试剂盒构成LAMP检测体系；25μL检测体系的具体配置为：PM预混引物:FIP/BIP(50UM)0.4μLFLOOP/BLOOP(50UM)0.4μLF3/B3(10UM)0.2μL提取DNA1.0-2.0μLBst酶1.5μL2×U-loadmixbuffer12.5μL含有钙黄素和锰离子的荣研Loopamp荧光染料0.4-1.0μLDEPC-treatedddH2O补充至25.0μL作为优选，所述试剂盒的检测反应条件为：63-65℃，45-90分钟；终止反应。作为优选，所述试剂盒的检测反应条件为：63℃，45-60分钟；终止反应。本专利技术针对PPVVP2基因设计了6条特异性引物，在引入一对环引物之后，大大提高了扩增效率，产生了大量扩增产物，所以，将含钙黄素的预混染料直接加入反应管，在反应结束后，就可以直接观察对比颜色变化，判断样品感染的有无。通过引入环引物，摸索最佳扩增温度，本专利技术成功建立了PPV快速一步法LAMP检测方法，并应用该方法检测了大量的田间血清以及组织样品，达到了预期效果，有望开发为可以在广大猪场现场直接使用的快速诊断试剂盒。本专利技术的试剂盒在不延长原有1小时反应时间的条件下，实现了将荧光染料直接加入反应管的一步操作，不仅简化了操作程序，解决了含有钙黄素的预混染料对BstDNA扩增酶的抑制而导致在反应管直接加入荧光染料不显色的根本问题，还有效避免了由于反应结束后二次开盖导致的释放产物形成气溶胶的污染发生。应用本专利技术的试剂盒进行检测，能够肉眼直接直观判断，具有良好的特异性、敏感性和稳定性。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为60-65℃不同温度条件下，PPV一步法快速显色LAMP图谱；图2为以10倍系列稀释的AV30毒株细胞毒DNA或者含有VP2编码基因的质粒为模板，进行PPV一步法快速显色LAMP检测结果；图3为以10倍系列稀释的DNA为模板，进行常规PCR（P16/P17引物对)检测结果；图4为PPV一步法快速显色LAMP分析特异性检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。毒株建立LAMP检测方法采用的两株PPV毒株分别为AV30株（CVCCAV30）和AV31株（CVCCAV31），均来自中国兽医药品监察所。用于分析特异性检测实验的其它与猪殖障碍性疫病有关的病毒毒株包括猪圆环病毒1型PCV1（CAU0672）、猪圆环病毒2型PCV2（CAU0673)、猪伪狂犬病毒RRV（CVCCAV250）和古典猪瘟病毒CSF（CVCCAV65，猪瘟弱毒株）均来自中国兽医药品监察所，在PK-15细胞传代后保存的细胞毒，HP-PRRSV（QH08毒株，由实验室从田间分离保存的Marc-145细胞毒，全基因组测序Genebank登录号：KU201579）和非高致病性PRRSV(CH-1R毒株，源自海利疫苗公司生产的蓝耳净猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，由实验室在Marc-145细胞传代的细胞毒）。临床样品用于临床检测的田间样品共有505份，其中猪血清101份，组织样品404份。这些田间样品经过ELISA、PK-15细胞接毒后间接免疫荧光IFA以及PCR检测和测序分析等综合方法确定是否为PPV感染。101份猪血清中41份为阳性，60份为阴性。组织样品包括肺脏组织71份（34份阳性，37份阴性），肝脏组织67份（32份阳性，35份阴性），心脏组织60份（阴、阳性各30份），肾脏组织70份（阳性33份，阴性37份），脾脏组织63份（31份阳性，32份阴性），淋巴结73份（37份阳性，36份阴性），提取核酸后，分别进行PPV一步法快速显色LAMP和常规PCR检测，用于检测新建立方法的临床特异性和敏感性。3.核酸扩增和提取相关试剂盒用于建立PPVLAMP方法的扩增试剂盒为北京美莱博医学科技有限公司的LAMP试剂盒以及日本荣研公司L本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测猪细小病毒的特异性LAMP引物组，其特征在于：所述引物组为以下六条引物：F3：5'‑gCACACgCATCAAgACTCATAC‑3'，B3：5'‑TggTggTgAggTTgCTgATTC‑3'，FIP：5'‑gCATCgTCTTgTACCATTTgTCCCTgCCAgAACACgAAACATACAA‑3'，BIP：5'‑CCTTggTCACTAATAgATgCTAACgCAgTTTATTTCTgTCATgTTgTTggA‑3'，FLoop：5'‑TAAATTCAgAATCAggggTggC‑3'，BLoop：5'‑gCCAgTCCgCTggATTgAA‑3'。
【技术特征摘要】
1.用于检测猪细小病毒的特异性LAMP引物组，其特征在于：所述引物组为以下六条引物：F3：5'-gCACACgCATCAAgACTCATAC-3'，B3：5'-TggTggTgAggTTgCTgATTC-3'，FIP：5'-gCATCgTCTTgTACCATTTgTCCCTgCCAgAACACgAAACATACAA-3'，BIP：5'-CCTTggTCACTAATAgATgCTAACgCAgTTTATTTCTgTCATgTTgTTggA-3'，FLoop：5'-TAAATTCAgAATCAggggTggC-3'，BLoop：5'-gCCAgTCCgCTggATTgAA-3'。2.一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括含有钙黄素和锰离子的荧光染料。4.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，张永光，刘永生，丁耀忠，陈豪泰，常惠芸，吕建亮，林彤，潘丽，刘新生，王永录，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。