本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用，包括a.连续两年的耐涝性鉴定；b.菊花品种群体结构及亲缘关系分析；c.关联模型的比较和选择；d.与菊花耐涝性显著关联的分子标记的确定；e.优异等位变异挖掘及亲本选拔。本发明专利技术采用盆栽模拟淹水法对100个菊花品种进行连续两年的耐涝性鉴定，采用全基因组关联分析方法检测与耐涝性紧密关联的分子标记位点并进行了优异等位变异的挖掘。本发明专利技术检测到4个标记位点与菊花耐涝性显著关联，挖掘了2个优异等位变异并筛选了6份优异菊花品种，这不仅为菊花耐涝性杂交育种工作提供了优异亲本材料也为分子标记辅助育种(MAS)选择提供了一定参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用，可为菊花耐涝栽培调控及定向培育具有较强耐涝性的菊花新品种提供理论依据。
技术介绍
菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是我国的传统名优花卉也是世界四大切花之一，具有很高的经济和观赏价值。菊花为浅根，喜疏松肥沃排水良好土壤，夏季集中降雨积水往往导致涝渍胁迫。研究表明持续水淹条件下菊花表现为根系活力下降、叶绿素和叶片净光合速率降低、叶片萎蔫、干枯，严重影响菊花的品质并且会导致菊花大面积死亡[1]。因此，培育耐涝性菊花新品种是解决这一问题的直接有效方法，也是菊花育种工作的重要任务之一。植物耐涝性受多种遗传机制以及温度、植物生长发育阶段、营养水平、土壤结构等多种环境因素的影响，是一个复杂的数量性状。目前在各个物种上耐涝性鉴定的标准尚未统一。因此，建立科学合理的菊花耐涝评价体系是开展菊花耐涝机制研究的重要前提。尹冬梅等[2]根据菊花及其近缘种属植物在盆栽淹水处理过程的表型变化，采用叶色、叶形态、茎色、茎形态等外观形态指标建立了菊花耐涝性评价体系，并据此对部分菊花及其近缘种属植物进行耐涝性鉴定，筛选出部分耐涝性强的优异种质。此外，目前在菊花上耐涝性状的研究主要集中在涝胁迫后植株在形态、细胞学、解剖学、生理生化方面的变化[3-6]，尚无菊花耐涝性相关分子遗传机制的研究。关联分析(连锁不平衡作图或关联作图)以连锁不平衡(linkagedisequilibrium，LD)为基础，以自然群体为研究对象，检测群体内目标性状与遗传标记或候选基因的遗传变异的显著关联。相比传统的QTL连锁作图技术，关联分析具有研究周期短、可同时对同一基因座的多个等位基因进行分析、定位精度高、可以通过多年，多点试验去除环境因子对性状统计的影响等优点，已经成功应用在很多物种上并对各种性状进行了关联位点的挖掘[7-9]，但是关于其在植物非生物胁迫上，尤其是涝胁迫上应用的报道比较少。本专利技术是首次报道运用关联分析方法挖掘与菊花耐涝性显著关联的分子标记位点，以期为菊花耐涝性分子标记辅助育种提供一定参考。[1]Shabala,S.(2011)Physiologicalandcellularaspectsofphytotoxicitytoleranceinplants:theroleofmembranetransportersandimplicationsforcropbreedingforwaterloggingtolerance.NewPhytologist,190,289-298.[2]Yin,D.,Guan,Z.,Chen,S.andChen,F.(2009b)EstablishmentofevaluationsystemforwaterloggingtoleranceandidentificationofwaterloggingtoleranceinChrysanthemummorifoliumanditsrelatedgeneraplants.JournalofPlantGeneticResources,10,399-404.[3]Yin,D.,Chen,S.,Chen,F.,Guan,Z.andFang,W.(2009a)Morphologicalandphysiologicalresponsesoftwochrysanthemumcultivarsdifferingintheirtolerancetowaterlogging.Environmentalandexperimentalbotany,67,87-93.[4]Yin,D.,Zhang,Z.andLuo,H.(2012)AnatomicalresponsestowaterlogginginChrysanthemumzawadskii.Scientiahorticulturae,146,86-91[5]WANG,L.,WANG,C.-c.,JIANG,J.-f.,CHEN,S.-m.,FANG,W.-m.,TENG,N.-j.,etal.(2013)InterspecificHybridizationBetweenChrysanthemummorifolium‘Nannongyinshan’andC.zawadskiiandIdentificationofWaterloggingToleranceofTheirHybrid.ScientiaAgriculturaSinica,20,023.[6]LIAN,H.-y.,WANG,X.-j.andWU,Y.(2014)EffectofWaterloggingStressonMorphologyandSomePhysiologicalIndexofChrysanthemummorifolium.JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity,1,009.[7]Brachi,B.,Faure,N.,Bergelson,J.,Cuguen,J.andRoux,F.(2013)Genome-wideassociationmappingoffloweringtimeinArabidopsisthalianainnature:geneticsforunderlyingcomponentsandreactionnormsacrosstwosuccessiveyears.ActaBotanicaGallica,160,205-219.[8]Hwang,E.-Y.,Song,Q.,Jia,G.,Specht,J.E.,Hyten,D.L.,Costa,J.,etal.(2014)Agenome-wideassociationstudyofseedproteinandoilcontentinsoybean.BMCgenomics,15,1.[9]Phung,N.T.P.,Mai,C.D.,Hoang,G.T.,Truong,H.T.M.,Lavarenne,J.,Gonin,M.,etal.(2016)Genome-wideassociationmappingforroottraitsinapanelofriceaccessionsfromVietnam.BMCplantbiology,16,1.
技术实现思路
针对菊花耐涝性分子遗传机制、优异关联位点挖掘的研究在国内外几乎空白这一现状，本专利技术通过利用关联分析方法筛选出多个与菊花耐涝性基因紧密关联的分子标记并对优异等位变异进行挖掘，从而提高菊花优良耐涝性种质资源的选择效率，为菊花传统杂交育种工作提供优异亲本材料，也对菊花耐涝性分子标记辅助育种(MAS)选择提供了一定参考。本专利技术的目的通过以下技术手段获得：一种鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，包括以下步骤：a、耐涝性鉴定：选取多份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，处理组10-12叶龄苗时进行涝处理，对照组植株正常管理；淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率；萎蔫指数分级标准为：1级：植本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤：a、耐涝性鉴定：选取多份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，处理组10‑12叶龄苗时进行涝处理，对照组植株正常管理；淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率；萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显；采用隶属函数法求出每个指标的隶属函数值，计算公式为：若该指标数据与耐涝性是正相关关系，则Xi＝(X‑Xmin)÷(Xmax‑Xmin)；若该指标数据与耐涝性是负相关关系，则Xi＝1‑(X‑Xmin)÷(Xmax‑Xmin)；其中，X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；用各个品种所有指标的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的耐涝性，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强；b、菊花品种群体结构和亲缘关系分析：1)利用分子标记数据采用STRUCTURE软件对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率得到Q‑矩阵，并绘制出群体结构图；2)采用TASSEL软件对该群体进行主成分分析，将累积解释率达到25％的前几个主成分构建PC‑矩阵并用于后续关联分析；3)根据三种标记的整合数据采用SPAGeDi软件分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K‑矩阵；c、关联模型的比较和选择：将步骤b中所得到的Q‑矩阵、PC‑矩阵及K‑矩阵作为/不作为协变量构建了6种关联分析模型：3种一般线性模型包括GLM，GLM+Q和GLM+PC及3种混合线性模型包括MLM，MLM+Q和MLM+PC；结合分子和表型数据在TASSEL中绘制Q‑Q图并根据观察–log P值与期望–log P值的偏离程度大小选择最优模型，其中偏离程度越小，模型越能控制Ⅰ类错误和Ⅱ类错误；d、与菊花耐涝性紧密关联的分子标记的确定：根据步骤c中选择的最优模型应用TASSLE软件对两年重复试验得到的表型数据结合分子标记数据分别进行关联分析；以两年数据的关联分析都能检测到的显著标记位点(P<0.01)为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。...
【技术特征摘要】
1.一种鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤：a、耐涝性鉴定：选取多份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，处理组10-12叶龄苗时进行涝处理，对照组植株正常管理；淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率；萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显；采用隶属函数法求出每个指标的隶属函数值，计算公式为：若该指标数据与耐涝性是正相关关系，则Xi＝(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；若该指标数据与耐涝性是负相关关系，则Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；其中，X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；用各个品种所有指标的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的耐涝性，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强；b、菊花品种群体结构和亲缘关系分析：1)利用分子标记数据采用STRUCTURE软件对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率得到Q-矩阵，并绘制出群体结构图；2)采用TASSEL软件对该群体进行主成分分析，将累积解释率达到25％的前几个主成分构建PC-矩阵并用于后续关联分析；3)根据三种标记的整合数据采用SPAGeDi软件分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K-矩阵；c、关联模型的比较和选择：将步骤b中所得到的Q-矩阵、PC-矩阵及K-矩阵作为/不作为协变量构建了6种关联分析模型：3种一般线性模型包括GLM，GLM+Q和GLM+PC及3种混合线性模型包括MLM，MLM+Q和MLM+PC；结合分子和表型数据在TASSEL中绘制Q-Q图并根据观察–logP值与期望–logP值的偏离程度大小选择最优模型，其中偏离程度越小，模型越能控制Ⅰ类错误和Ⅱ类错误；d、与菊花耐涝性紧密关联的分子标记的确定：根据步骤c中选择的最优模型应用TASSLE软件对两年重复试验得到的表型数据结合分子标记数据分别进行关联分析；以两年数据的关联分析都能检测到的显著标记位点(P<0.01)为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。2.根据权利要求1所述的鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于：步骤a中选取100份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，采用盆栽淹水法对供试材料进行高出土面3cm的涝处理，采用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值Xi作为最终各品种的耐涝性鉴定数据，由于萎蔫指数和死叶率与耐涝性成负相关，隶属函数值Xi计算公式为：Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)。3.根据权利要求1或2所述的鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于：步骤b中运用STRUCTURE软...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈发棣，苏江硕，张飞，王海滨，管志勇，房伟民，廖园，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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