本发明专利技术公开了一种重组表达果聚糖蔗糖酶的基因工程菌株及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术构建重组质粒pNCMO2‑Lsc，转化短小芽孢杆菌得到重组短小芽孢杆菌。并以此短小芽孢杆菌为菌种发酵生产果聚糖蔗糖酶，所生产的果聚糖蔗糖酶应用于制备低聚乳果糖，具有比较好的效果。本发明专利技术的优点在于以食品安全的短小芽孢杆菌为表达宿主，重组生产果聚糖蔗糖酶，该重组菌株产酶水平高、发酵原料来源广泛，生产成本较低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组表达果聚糖蔗糖酶的基因工程菌株及其应用，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
果聚糖蔗糖酶是糖基转移酶家族中的一员，它除了具有转糖基活性，还有水解活性，可以将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。大部分果聚糖蔗糖酶具有广泛的受体活性，在转糖基过程中是以蔗糖作为其优先选择的底物供体，以木糖、蔗糖、乳糖等为受体，催化转移果糖残基到受体的碳链上，促进碳链延伸，从而形成低聚果糖、果聚糖以及低聚乳果糖等产物。由于低聚果糖、低聚乳果糖等低聚糖对人体健康有益，因此，果糖基转移酶的生产越来越受到人们的关注。目前已经发现多种细菌可以产果聚糖蔗糖酶，如多黏芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、金山乳杆菌(Lactobacillussanfranciscensis)、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、粘性放线菌(Actinomycesviscosus)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringae)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)等。这些菌株生产果聚糖蔗糖酶的能力差别较大，所产果聚糖蔗糖酶对受体的专一性及酶转化获得的产物性质也有较大区别。低聚乳果糖(lactosucrose,LS)是一种三糖，它由β-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷和β-D-呋喃果糖苷残基组成，所以它可以被看作是一分子乳糖与一分子果糖的缩合物，或者是一分子半乳糖与一分子蔗糖的缩合物，其化学名称应为β-D-半乳糖基蔗糖，但习惯上，人们将其称为低聚乳果糖。低聚乳果糖是一种功能性低聚糖，它易溶于水，甜度约为蔗糖的70％，几乎不被生物体消化和吸收，是双歧杆菌的有效增殖因子，其增值效果比其他功能性低聚糖如低聚果糖、低聚半乳糖等更好。低聚乳果糖同时具有低热量、低龋齿、降低血液中的胆固醇、改善血脂、促进钙吸收等特殊的生理功能，可作为一种功能保健食品。国内对低聚乳果糖做了初步研究，还没有工业化生产的报道，而在日本低聚乳果糖已经进入市场多年。由于其具有广阔的应用前景，近年来低聚乳果糖的研究开发受到了极大地重视。
技术实现思路
本专利技术第一个目的是提供一种产果聚糖蔗糖酶的重组短小芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)，是将来源于弯曲芽孢杆菌的编码果聚糖蔗糖酶的基因导入短小芽孢杆菌得到的基因工程菌。所述编码果聚糖蔗糖酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术第二个目的是提供一种构建分泌表达果聚糖蔗糖酶的重组短小芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：1)扩增SEQIDNO.1所示的目的基因，连接到载体pNCMO2上，转化E.coliJM109，涂布具有抗性的LB平板培养基，获取重组质粒pNCMO2-Lsc；2)将重组质粒pNCMO2-Lsc通过电转化进入短小芽孢杆菌中，涂布具有抗性的TM平板培养基，获得短小芽孢杆菌基因工程菌。本专利技术的第三个目的是提供一种利用所述的短小芽孢杆菌基因工程菌生产果聚糖蔗糖酶的方法，是将活化后的短小芽孢杆菌基因工程菌接种到发酵培养基中，于30℃、200r/min培养48小时，将获得的发酵液离心除菌体，获得的发酵上清液即为粗酶液。所述发酵培养基的配方为：工业酵母粉1.7％、葡萄糖或蔗糖1％。本专利技术的第四个目的是提供一种利用重组果聚糖蔗糖酶转化淀粉制备低聚乳果糖的方法，包括(1)利用所述的短小芽孢杆菌基因工程菌生产果聚糖蔗糖酶，(2)以蔗糖和乳糖为底物转化生产低聚乳果糖，底物蔗糖和乳糖浓度均为200g/L，加酶量为0.5-5U/g底物，起始pH6.0～7.0，反应温度35℃，150r/min的搅拌速度。在本专利技术的一种实施方式中，所述加酶量为2U/g底物。利用本专利技术构建得到的重组得到的短小芽孢杆菌发酵产重组果聚糖蔗糖酶，发酵上清液酶活在43U/mL。进一步利用该重组果聚糖蔗糖酶催化蔗糖和乳糖生成低聚乳果糖，转化率可达39.01％。本专利技术以食品安全的短小芽孢杆菌为表达宿主，重组生产果聚糖蔗糖酶，该重组菌株产酶水平高、发酵原料来源广泛，生产成本较低。附图说明图1重组菌摇瓶发酵产酶曲线图2重组菌摇瓶发酵胞外上清SDS-PAGE电泳图；M：Marker，1：重组菌发酵上清图3不同氮源对B.brevis摇瓶发酵生物量和产酶的影响图4不同碳源对B.brevis摇瓶发酵生物量和产酶的影响图5加酶量和反应时间对低聚乳果糖转化率的影响图6温度对低聚乳果糖转化率的影响图7pH对低聚乳果糖转化率的影响具体实施方式实施例1弯曲芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶编码基因的克隆及表达载体的构建弯曲芽孢杆菌在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μLTris-EDTA缓冲液，加入15uL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μLRNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％十二烷基硫酸钠和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入5M的NaCl100μL和十六烷基三甲基溴化铵80μL，65℃下保温20min，用700μL的酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿：异戊醇体积比为24:1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL70％浓度的乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为弯曲芽孢杆菌总DNA；根据数据库中的聚糖蔗糖酶基因设计引物P1、P2：P1：5’-CGGGATCCAAAGGTAAAGGTGTAGATGAAG-3’P2：5’-GGAATTCTTATTTTTTCTTTTCATCATACGTG-3’以原始菌基因组为模板，克隆含编码信号肽序列的目的基因，PCR体系为：10μM引物P1和P2各1μL，2mMdNTPS5μL，10×KOD-Plus-NeoBuffer5μL，1U/μL的PrimeStar聚合酶1uL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL。PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环。得到序列如SEQIDNO.1所示的编码果聚糖蔗糖酶的基因Lsc。将PCR产物和载体pNCMO2分别进行双酶切，并胶回收，于16℃连接过夜，转化E.coliJM109，涂布含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取3个转化子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pNCMO2-Lsc。实施例2短小芽孢杆菌的转化1)新鲜TM平板(TM培养基：多聚蛋白胨1％，牛肉浸膏0.5％，酵母粉0.2％，葡萄糖1％)挑短小芽孢杆菌为Brevibacillusbrevis(CCTCC94025)单菌落接种于10mlTM培养基中，过夜培养。2)测量摇瓶内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD600在0.19-0.2之间。培养基为50mLGM培养基(蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌表达果聚糖蔗糖酶的重组短小芽孢杆菌，其特征在于，是将来源于弯曲芽孢杆菌的编码果聚糖蔗糖酶的基因导入短小芽孢杆菌得到的基因工程菌，所述编码果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种分泌表达果聚糖蔗糖酶的重组短小芽孢杆菌，其特征在于，是将来源于弯曲芽孢杆菌的编码果聚糖蔗糖酶的基因导入短小芽孢杆菌得到的基因工程菌，所述编码果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种构建权利要求1所述的分泌表达果聚糖蔗糖酶的重组短小芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)扩增SEQIDNO.1所示的目的基因，连接到载体pNCMO2上，转化E.coliJM109，涂布具有抗性的LB平板培养基，获取重组质粒pNCMO2-Lsc；2)将重组质粒pNCMO2-Lsc通过电转化进入短小芽孢杆菌中，涂布具有抗性的TM平板培养基，获得短小芽孢杆菌基因工程菌。3.一种利用权利要求1所述的短小芽孢杆菌基因工程菌生产果聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于，是将活化后的短小芽孢杆菌基因工程菌接种到发酵培养基中，于30℃、200r/min培养48小时，将获得的发酵液离心除菌体，获得的发酵上清液即为粗酶液；所述发酵培养基的配方为：工业酵母粉1.7％...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，陈晟，唐煜，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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