一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法技术

本发明专利技术公开了一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，包括如下步骤：(1)维生素B1对照品溶液和维生素B1同位素内标溶液配制；(2)建立维生素B1标准曲线；(3)采集血清样品溶液的色谱图；(4)血清样品中维生素B1浓度的确定；(5)采集质控样品和加标回收率样品溶液的色谱图；(6)加标回收率计算。本发明专利技术的一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法用于血清中维生素B1的测定中，简单快速、准确度高、专属性强、精密度高、灵敏度好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法。
技术介绍
维生素B1又称硫胺素，是B族维生素的主要成员，作为人体内众多辅酶中的一种，维生素B1参与碳水化合物和蛋白质的代谢，对维持神经、胃肠、肌肉，特别是心肌正常功能发挥重要作用。维生素B1缺乏后，会出现脚气病，主要表现为神经-血管系统的损伤，症状多为食欲不佳、便秘、恶心、抑郁、易疲劳、记忆减退、反应迟钝、周围神经障碍等。可见，维生素B1对维系人体健康十分重要，因此，需要建立一种简单快速、准确灵敏测定血清中维生素B1的方法。
技术实现思路
本专利技术实际解决的问题是一种简单快速、灵敏准确的测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法。本专利技术的一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，包括以下步骤：(1)维生素B1对照品溶液和维生素B1同位素内标溶液配制：用体积分数为50％的甲醇水溶液分别溶解维生素B1和维生素B1同位素内标，制成已知浓度的维生素B1对照品存储液和已知浓度的维生素B1同位素内标存储液；用体积分数为50％的甲醇水溶液将已知浓度的维生素B1对照品存储液分别稀释成一系列具有不同已知浓度的维生素B1对照品溶液；用甲醇溶液将已知浓度的维生素B1同位素内标存储液稀释成已知浓度的维生素B1同位素内标溶液；(2)建立维生素B1标准曲线：分别吸取一系列具有不同已知浓度的维生素B1对照品溶液体积V1，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得到一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液；在相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，将体积V3的一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液的色谱图；以维生素B1标准曲线工作液的色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标或横坐标，以相应的维生素B1标准曲线工作液的维生素B1浓度为横坐标或纵坐标，建立维生素B1标准曲线；(3)采集血清样品溶液的色谱图：吸取血清样品体积V1，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得血清样品溶液；在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积V3的血清样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得血清样品溶液的色谱图；(4)血清样品中维生素B1浓度的确定：将血清样品溶液色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素B1标准曲线，计算出血清样品中维生素B1的浓度；(5)采集质控样品和加标回收率样品溶液的色谱图：吸取血清样品体积0.8V1，加入0.2V1不同已知浓度的维生素B1对照品溶液，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得到不同浓度的质控样品和加标回收率样品溶液；在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积V3的质控样品和加标回收率样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得质控样品和加标回收率样品溶液的色谱图；将质控样品和加标回收率样品溶液色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素B1标准曲线，计算出质控样品和加标回收率样品中维生素B1的浓度；(6)加标回收率计算：回收率％＝(测得浓度-血清平均浓度×0.8)/加标浓度×0.2×100％。进一步的，所述预设超高效液相色谱质谱条件包括：1)超高效液相色谱条件：色谱柱：采用极性基团包埋C18键合硅胶的固定相；流动相：盐水溶液-乙腈；流动相的流速：0.3～0.5mL/min；柱温：30～50℃；进样量：2～10μL；2)质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；检测模式：多反应监测；毛细管电压：5500V；离子源温度：550℃；离子源雾化气：40psi；离子源加热辅助气：60psi；气帘气：30psi；碰撞气：4psi。进一步的，所述流动相为甲酸铵/乙酸铵水溶液-乙腈。进一步的，所述流动相为0～20mM甲酸铵水溶液-乙腈。进一步的，所述流动相为10mM甲酸铵水溶液-乙腈。进一步的，所述离子源雾化气、离子源加热辅助气、气帘气和碰撞气中的气体均为氮气。进一步的，所述一系列具有不同已知浓度的维生素B1对照品溶液的浓度为0.5～100ng/mL。进一步的，所述涡旋混匀的时间为0.5～5min；进一步的，所述离心条件为：温度4℃，转速10000～15000r/min，时间10～20min。本专利技术的一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法用于血清中维生素B1的测定中，简单灵敏、快速准确、专属性强、精密度高、重复性好、准确度高。附图说明图1本专利技术中浓度均为5ng/mL的维生素B1及13C4-维生素B1的典型UPLC-MS/MS色谱图；图2维生素B1标准曲线图；图3质控样品和加标回收率样品溶液的典型UPLC-MS/MS色谱图；图4血清样品溶液中维生素B1及13C4-维生素B1的的典型UPLC-MS/MS色谱图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。仪器与试剂：API4000三重四级杆质谱仪(美国，AppliedBiosystem公司)配有电喷雾离子源；Waters超高效液相色谱仪(美国，Waters公司)配有二元高压泵、自动进样器、柱温箱；H1650R台式高速冷冻离心机(中国，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；BT125D电子天平(德国，赛多利斯股份公司)；G560E涡旋混合器(美国，ScientificIndustries公司)。盐酸维生素B1(纯度＞99％)、盐酸维生素B1-(4-甲基-13C-thiazol-5-yl-13C3)(盐酸13C4-维生素B1，纯度＞98％)购自SigmaAldrich公司(美国)；色谱甲醇、乙腈购自默克公司(德国)；色谱纯甲酸铵购自上海麦克林生化科技有限公司(中国)；屈臣氏蒸馏水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司(中国)；方法学研究实验的血清样本来自于杭州佰辰医学检验所有限公司送检的血清样本。本实施例的一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，包括以下步骤：(1)维生素B1对照品溶液和维生素B1同位素内标溶液配制：精密称取盐酸维生素B110.38mg(折算成维生素B1为9.26mg)，置于100mL容量瓶中，加入体积分数为50％甲醇水溶液定容至刻度，制成每1mL溶液中含92.6μg维生素B1对照品储备液；取同位素内标盐酸维生素B1-(4-甲基-13C-thiazol-5-yl-13C3)2.0mg(盐酸13C4-维生素B1，折算成13C4-维生素B1为1.79mg)，用体积分数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)维生素B1对照品溶液和维生素B1同位素内标溶液配制：用体积分数为50％的甲醇水溶液分别溶解维生素B1和维生素B1同位素内标，制成已知浓度的维生素B1对照品存储液和已知浓度的维生素B1同位素内标存储液；用体积分数为50％的甲醇水溶液将已知浓度的维生素B1对照品存储液分别稀释成一系列具有不同已知浓度的维生素B1对照品溶液；用甲醇将已知浓度的维生素B1同位素内标存储液稀释成已知浓度的维生素B1同位素内标溶液；(2)建立维生素B1标准曲线：分别吸取一系列具有不同已知浓度的维生素B1对照品溶液体积V1，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得到一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液；在相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，将体积V3的一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液的色谱图；以维生素B1标准曲线工作液的色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标或横坐标，以相应的维生素B1标准曲线工作液的维生素B1浓度为横坐标或纵坐标，建立维生素B1标准曲线；(3)采集血清样品溶液的色谱图：吸取血清样品体积V1，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得血清样品溶液；在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积V3的血清样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得血清样品溶液的色谱图；(4)血清样品中维生素B1浓度的确定：将血清样品溶液色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素B1标准曲线，计算出血清样品中维生素B1的浓度；(5)采集质控样品和加标回收率样品溶液的色谱图：吸取血清样品体积0.8V1，加入0.2V1不同已知浓度的维生素B1对照品溶液，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得到不同浓度的质控样品和加标回收率样品溶液；在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积V3的质控样品和加标回收率样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得质控样品和加标回收率样品溶液的色谱图；将质控样品和加标回收率样品溶液色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素B1标准曲线，计算出质控样品和加标回收率样品中维生素B1的浓度；(6)加标回收率计算：回收率％＝(测得浓度‑血清平均浓度×0.8)/加标浓度×0.2×100％。...

【技术特征摘要】
1.一种测定血清中维生素B1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)维生素B1对照品溶液和维生素B1同位素内标溶液配制：用体积分数为50％的甲醇水溶液分别溶解维生素B1和维生素B1同位素内标，制成已知浓度的维生素B1对照品存储液和已知浓度的维生素B1同位素内标存储液；用体积分数为50％的甲醇水溶液将已知浓度的维生素B1对照品存储液分别稀释成一系列具有不同已知浓度的维生素B1对照品溶液；用甲醇将已知浓度的维生素B1同位素内标存储液稀释成已知浓度的维生素B1同位素内标溶液；(2)建立维生素B1标准曲线：分别吸取一系列具有不同已知浓度的维生素B1对照品溶液体积V1，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得到一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液；在相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，将体积V3的一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的维生素B1标准曲线工作液的色谱图；以维生素B1标准曲线工作液的色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标或横坐标，以相应的维生素B1标准曲线工作液的维生素B1浓度为横坐标或纵坐标，建立维生素B1标准曲线；(3)采集血清样品溶液的色谱图：吸取血清样品体积V1，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得血清样品溶液；在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积V3的血清样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得血清样品溶液的色谱图；(4)血清样品中维生素B1浓度的确定：将血清样品溶液色谱图中维生素B1色谱峰峰面积与维生素B1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素B1标准曲线，计算出血清样品中维生素B1的浓度；(5)采集质控样品和加标回收率样品溶液的色谱图：吸取血清样品体积0.8V1，加入0.2V1不同已知浓度的维生素B1对照品溶液，加入1～5倍体积V1的维生素B1同位素内标溶液，涡旋混匀，离心，取上清液体积V2加入1～3倍体积V2的蒸馏水，涡旋混匀，得到不同浓度的质控样品和加标回收率样品溶液；在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭军，吴超超，高强，江振作，陈从艳，田天，
申请(专利权)人：杭州佰辰医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33