本发明专利技术涉及一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，首先将视网膜色素上皮细胞进行培养液的清除并进行洗涤，然后将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40‑50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Tryple select溶液按体积比为1:2‑3混合制成消化液进行消化分离，最后经过计数、离心后进行冻存。本发明专利技术分离方法简单，步骤易于控制，采用DispaseⅡ分离酶和Tryple select溶液混合制成消化液对视网膜色素上皮细胞进行消化分离，能够缩短视网膜色素上皮细胞解除贴壁的时间，同时保持细胞的完整性，对细胞的损伤大大降低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，属于生物材料
技术介绍
视网膜退行性病变是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病。其中年龄相关性黄斑变性患者，全球大约有3千万到5千万，而视网膜色素变性患者约一百万。目前我国的年龄相关性黄斑变性患者大约超过2000万人，并预计将在2050年增加一倍。因此研究人类视网膜色素上皮细胞并找到针对性的治疗方案是目前生物医疗方向研究的重点课题之一。在人类视网膜色素上皮细胞的消化过程中传统胰酶效果不佳：对视网膜色素上皮细胞消化能力一般，解除贴壁的能力相对较弱，并不能完整的将视网膜色素上皮细胞解除贴壁状态；对视网膜色素上皮细胞的解除贴壁时间不能完全确定，需要进行摸索才能确定；如延长消化时间会破坏视网膜色素上皮细胞的功能。目前市场上存在的视网膜色素上皮细胞消化方式为胰酶消化，其工作方式为：(1)将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去上清液。(2)用DPBS(CTS)5ml清洗1次。(3)加入胰酶2ml，放入37.0℃的二氧化碳培养箱中消化15min。(4)时间结束后将细胞转移至含血清的培养基中终止消化。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的消化酶不适合处理视网膜色素上皮细胞的问题，提供了一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法。本专利技术采用如下技术方案：一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，包括如下步骤：一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)清除培养液：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去培养液；(2)洗涤：向培养瓶内加入DPBS(CTS)缓冲液5～10ml，轻轻摇匀，完全洗涤后移除液体；(3)消化：将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40-50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Trypleselect溶液按体积比为1:2-3混合制成消化液，向步骤(2)中的培养瓶中加入消化液2～3ml，充分混匀后放入二氧化碳培养箱中继续培养10～15min；(4)准备：在离心管中加入视网膜色素上皮细胞培养基3～5ml备用；(5)终止：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，加入2～3ml视网膜色素上皮细胞培养基终止反应，吹打细胞，将视网膜色素上皮细胞收集至准备好的离心管中；(6)计数：将视网膜色素上皮细胞混匀后取50～100ul细胞悬液进行细胞活率计数；(7)离心：将收集好的视网膜色素上皮以1800～2200rpm/min离心，离心时间为5～10min；(8)冻存：离心结束后弃去上清，根据细胞计数结果加入冻存液Cryo-SFM，调整细胞密度为1×106/ml，分装至冻存管中进行冻存。进一步的，所述步骤(2)中采用DPBS(CTS)缓冲液洗涤3-5次。进一步的，所述视网膜色素上皮细胞在二氧化碳培养箱中的培养条件为温度37-37.5℃，5-5.5％二氧化碳浓度。进一步的，所述视网膜色素上皮细胞培养基中包含组分为：αMEM培养基、N1添加剂，谷氨酰胺、非必须氨基酸、牛磺酸、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸和人血小板裂解液。进一步的，所述步骤(8)中冻存时首先在3.5-4℃条件下保存30-35min，然后在-20--25℃保存2-2.5h后置于-80-85℃保存8-8.5h，最后转移至液氮罐中。本专利技术分离方法简单，步骤易于控制，采用DispaseⅡ分离酶和Trypleselect溶液混合制成消化液对视网膜色素上皮细胞进行消化分离，能够缩短视网膜色素上皮细胞解除贴壁的时间，同时保持细胞的完整性，对细胞的损伤大大降低。附图说明图1为本专利技术实施例1消化液消化15min后培养瓶中残余结果示意图。图2为本专利技术对比例1胰酶消化15min后培养瓶中残余结果示意图。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步的描述。本专利技术中的谷氨酰胺、非必须氨基酸购自LIFETECHOLOGISE公司；DPBS(CTS)购自GIBCO公司；DispaseⅡ购自ROCHE罗氏公司；胰酶购自INVITROGEN公司；αMEM培养基、N1添加剂、牛磺酸、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸购自SIGMA公司；人血小板裂解液购自HELIOS公司；Cryo-SFM购自PromoCell公司视网膜色素上皮细胞的培养基配制：α修饰低限基本培养基(MEM，αmodification)500ml，N1添加剂(N1supplement)5ml，谷氨酰胺(Glutamine)5ml，非必须氨基酸(Nonessentialaminoacids)5ml，牛磺酸(Taurine)150mg，氢化可的松(Hydrocortisone)15ug，三碘甲状腺原氨酸(Triiodo-thyronin)0.010ug，人血小板裂解液(HPL)50ml。实施例1：一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，包括如下步骤：(1)清除培养液：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去培养液。(2)洗涤：向培养瓶内加入DPBS(CTS)5ml，轻轻摇匀，完全洗涤后移除液体。(3)消化：向培养瓶中加入视网膜色素上皮细胞消化液2ml，充分混匀后放入二氧化碳培养箱中10min。(4)准备：取15ml离心管1个，加入视网膜色素上皮细胞培养基3ml备用；(5)终止：时间结束后将视网膜色素上皮细胞取出，加入2ml视网膜色素上皮细胞培养基终止反应，用手动移液器进行吹打细胞，将细胞收集至准备好的15ml离心管中；(6)观察：将废弃的培养瓶放在倒置显微镜下观察消化残余情况；(7)计数：将细胞混匀后取50ul细胞悬液进行细胞活率计数；(8)离心：将收集好的细胞以1800rpm/min，5min离心；(9)冻存：离心结束后弃去上清，根据细胞计数结果加入适量冻存液，调整细胞密度为1×106/ml，分装至2ml冻存管中，每管500ul。消化液的配制过程：1g的DispaseⅡ，50mL的DPBS缓冲液，100mL的Trypleselect，充分溶解混匀后，分装放在-20℃保存实施例2：一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，包括如下步骤：(1)清除培养液：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去培养液；(2)洗涤：向培养瓶内加入DPBS(CTS)10ml，轻轻摇匀，完全洗涤后移除液体；(3)消化：向培养瓶中加入视网膜色素上皮细胞消化液3ml，充分混匀后放入二氧化碳培养箱中15min；(4)准备：取15ml离心管1个，加入视网膜色素上皮细胞培养基5ml备用；(5)终止：时间结束后将视网膜色素上皮细胞取出，加入3ml视网膜色素上皮细胞培养基终止反应，用手动移液器进行吹打细胞，将细胞收集至准备好的15ml离心管中；(6)观察：将废弃的培养瓶放在倒置显微镜下观察消化残余情况；(7)计数：将细胞混匀后取100ul细胞悬液进行细胞活率计数；(8)离心：将收集好的细胞以2200rpm/min，10min离心；(9)冻存：离心结束后弃去上清，根据细胞计数结果加入适量冻存液，调整细胞密度为1×106/ml，分装至2ml冻存管中，每管500ul。消化液的配制过程：1g的Dispase本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）清除培养液：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去培养液；（2）洗涤：向培养瓶内加入DPBS（CTS）缓冲液5~10ml，轻轻摇匀，完全洗涤后移除液体；（3）消化：将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40‑50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Tryple select溶液按体积比为1:2‑3混合制成消化液，向步骤（2）中的培养瓶中加入消化液2~3ml，充分混匀后放入二氧化碳培养箱中继续培养10~15min；（4）准备：在离心管中加入视网膜色素上皮细胞培养基3~5ml备用；（5）终止：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，加入2~3ml视网膜色素上皮细胞培养基终止反应，吹打细胞，将视网膜色素上皮细胞收集至准备好的离心管中；（6）计数：将视网膜色素上皮细胞混匀后取50~100ul细胞悬液进行细胞活率计数；（7）离心：将收集好的视网膜色素上皮以1800~2200 rpm/min离心，离心时间为5~10min；（8）冻存：离心结束后弃去上清，根据细胞计数结果加入冻存液Cryo‑SFM，调整细胞密度为1×106/ml，分装至冻存管中进行冻存。...
【技术特征摘要】
1.一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）清除培养液：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去培养液；（2）洗涤：向培养瓶内加入DPBS（CTS）缓冲液5~10ml，轻轻摇匀，完全洗涤后移除液体；（3）消化：将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40-50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Trypleselect溶液按体积比为1:2-3混合制成消化液，向步骤（2）中的培养瓶中加入消化液2~3ml，充分混匀后放入二氧化碳培养箱中继续培养10~15min；（4）准备：在离心管中加入视网膜色素上皮细胞培养基3~5ml备用；（5）终止：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，加入2~3ml视网膜色素上皮细胞培养基终止反应，吹打细胞，将视网膜色素上皮细胞收集至准备好的离心管中；（6）计数：将视网膜色素上皮细胞混匀后取50~100ul细胞悬液进行细胞活率计数；（7）离心：将收集好的视网膜色素上皮以1800~2200rpm/min...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢磊，李宁，范国平，方攀峰，秦承学，陆梦华，
申请(专利权)人：江苏艾尔康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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