山药真伪鉴别的方法及专用引物技术

本发明专利技术公开了山药真伪鉴别的方法及专用引物。本发明专利技术提供了用于山药真伪鉴别的物质。本发明专利技术提供的物质，为能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质；所述DNA片段A为序列表中序列3所示的核苷酸。本发明专利技术通过对正品山药特异性鉴别引物进行PCR条件优化，通过优化退火温度、变性温度、变性时间和退火时间及减少循环数等影响PCR反应的因素，使山药的分子鉴别在30min以内即可完成，进而建立一种快速、简单、直观的山药分子鉴别方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种山药真伪鉴别的方法及专用引物。
技术介绍
山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎，具有补脾养胃，生津益肺，补肾涩精的功效。目前市场上发现的混伪品有：薯蓣科植物褐苞薯蓣DioscoreapersimilisprainetBurkill、参薯DioscoreaalataLinn.、日本薯蓣DioscoreajaponicaThunb.、山薯DioscoreafordiiprainetBurkill的根茎及大戟科植物木薯ManihotesculehtaCrantz和旋花科植物番薯Ipomoeabatatas(L.)Lam块根。其中前四种分别作为湖南省、浙江省、福建省、广西省、广东省等地的中药材标准和地方习用品。随着山药需求的增加以及价格的上涨，市场上有越来越多的混伪品出现，常常为刮去外皮、切片、加工成与山药相似的形状，又因为大部分为同属同科植物，所以采用传统的鉴别方法——性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、含量测定等都不能很好地用来鉴别山药。随着中药分子鉴定的快速发展，DNA分子鉴定方法作为传统鉴别技术的有益补充，要求其应具有快速、准确、操作简便、实验成本低廉的特点。然而目前有关山药DNA条形码的研究报道，梁欣健等研究结果表明，DNA条形码鉴别以psbA-trnH+rbcL+matK复合序列的鉴别效果最佳,但此方法操作复杂，用时较长。因此，建立准确、快速、高通量、低成本鉴定方法一直是中药鉴定的追求，探索快速分子鉴别方法对于中药材分子鉴别的现场运用具有十分重要的实践意义和实用价值。专利技术内容本专利技术一个目的是提供用于山药真伪鉴别的物质。本专利技术提供的物质，为能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质；所述DNA片段A为序列表中序列3所示的核苷酸。上述物质中，所述能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质由引物1和引物2组成；所述引物1为如下1)或2)：1)为序列1所示的单链DNA分子；2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；所述引物2为如下3)或4)：3)为序列2所示的单链DNA分子；4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。本专利技术另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助山药的PCR试剂。上述PCR试剂，包括上述的物质、DNA聚合酶和dNTP。上述的PCR试剂中，所述引物对中每条引物在所述PCR试剂中的浓度均为6.4ng/μL。本专利技术第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定山药的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述的物质或上述的PCR试剂。本专利技术第三个目的是提供一种DNA片段A。本专利技术提供的DNA片段A，其核苷酸序列为序列3。上述的物质或上述的PCR试剂或上述的试剂盒或上述的DNA片段A在如下(A1)-(A5)中任一种中的应用也是本专利技术保护的范围：(A1)鉴定或辅助鉴定山药；(A2)鉴别或辅助鉴别山药；(A3)鉴别或辅助鉴别山药及其伪品；(A4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为山药；(A5)鉴定或辅助鉴定待测样品是山药还是其伪品。本专利技术第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否为山药的方法。本专利技术提供的方法，为方法A或方法B：方法A包括如下步骤：检测待测样品中是否含有上述的DNA片段A；如果含有，则待测样品为或候选为山药；如果不含有，则待测样品不为或候选不为山药；方法B包括如下步骤：检测待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，则待测样品为或候选为山药；如果不是，则待测样品不为或候选不为山药。上述方法中，所述检测待测样品中是否含有DNA片段A或所述检测待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T的方法包括如下步骤：1)用上述的物质待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)用如下a或b检测所述PCR扩增产物：a、向所述PCR扩增产物中加入DNA荧光染料，紫外检测，若PCR扩增产物有荧光，则待测样品含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，若PCR扩增产物无荧光，则待测样品不含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T；b、检测所述PCR扩增产物大小，若大小为270-280bp，则待测样品含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，若大小不为270-280bp，则待测样品不含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T。上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA；所述PCR扩增条件为83℃预变性1min，83℃变性15s，65℃退火30s，30个循环，72℃延伸30s。决定PCR特异性的一个重要因素是退火温度，退火温度越高，特异性越强。因此，在保证只有正品山药能够扩增出目的基因的前提下，尽量提高退火温度。决定PCR特异性的另外一个因素是变性温度，在保证模板DNA能够充分开链的基础上，尽量降低变性温度，而且变性温度与退火温度相差越小，PCR升降温时所用的时间越短。为缩短时间，提高效率，把常规的PCR三步法改为变性-退火延伸两步法，并且在保证正品山药能够扩增出目的基因的前提下，尽量缩短变性、退火时间，减少循环次数，从而实现快速PCR的过程。本专利技术的实验证明，本专利技术通过对正品山药特异性鉴别引物进行PCR条件优化，通过优化退火温度、变性温度、变性时间和退火时间及减少循环数等影响PCR反应的因素，选择快速DAN聚合酶，使整个PCR过程在30min左右即可完成，大大缩短了PCR反应的时间，在PCR扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料，省掉琼脂糖凝胶电泳的步骤，缩短时间，使山药的分子鉴别在30min以内即可完成，进而建立一种快速、简单、直观的山药分子鉴别方法。附图说明图1为PCR扩增产物电泳图。图2为引物Sy75-76不同条件下PCR扩增反应电泳图。图3为引物Sy89-90不同条件下PCR扩增反应电泳图。图4为引物Sy91-92不同条件下PCR扩增反应电泳图。图5为不同DNATaq聚合酶预混合液重复性考察结果。图6为灵敏度检测结果图。图7为样品验证电泳及荧光检测结果图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中山药正品及混伪品共3个科3个属7个物种共14份样品均为鲜品，来源情况统计如表1所示：表1为实验材料下述实施例中BIO-RAD通用电泳仪(北京市六一仪器厂)，DHS96G基因扩增仪(北京鼎昊源科技有限公司)，G：BOX凝胶成像系统(英国Syngene)，KDC-160HP高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，GR60DF全自动立式高压灭菌器(致微(厦门)仪器有限公司)，P7021TP-6微波炉(佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司)。DNAmarke(生工生物工程(上海)股份有限公司)，2×TaqPl本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于山药真伪鉴别的物质，为能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质；所述DNA片段A为序列表中序列3所示的核苷酸。

【技术特征摘要】
1.用于山药真伪鉴别的物质，为能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质；所述DNA片段A为序列表中序列3所示的核苷酸。2.根据权利要求1所述的物质，其特征在于：所述能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质由引物1和引物2组成；所述引物1为如下1)或2)：1)为序列1所示的单链DNA分子；2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；所述引物2为如下3)或4)：3)为序列2所示的单链DNA分子；4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。3.一种用于鉴定或辅助山药的PCR试剂，包括权利要求1或2所述的物质、DNA聚合酶和dNTP。4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物对中每条引物在所述PCR试剂中的浓度均为6.4ng/μL。5.一种鉴定或辅助鉴定山药的试剂盒，包括权利要求1或2所述的物质或权利要求3或4所述的PCR试剂。6.一种DNA片段A，其核苷酸序列为序列3。7.权利要求1或2所述的物质或权利要求3或4所述的PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒或权利要求6所述的DNA片段A在如下(A1)-(A5)中任一种中的应用：(A1)鉴定或辅助鉴定山药；(A2)鉴别或辅助鉴别山药；(A3)鉴别或辅助鉴别山药及其伪品；(A4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为山药；(A5)鉴定或辅助鉴定待测样品是山药还是其伪品。8.一种检测或辅助检测待测样品是否为山药的方法，为方法A或方法B：方法A包括如下步骤：检测待测样品中是否含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，杨晶凡，赵玉洋，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11