使用Y‑接头和消失限制位点的文库构建制造技术

本公开描述构建基因组DNA片段文库的系统和方法，所述构建过程是通过以下步骤来进行的：将基因组DNA延伸于经接头修饰的芯片上方；使用包含第一限制酶、连接酶和第二限制酶的酶混合物来将基因组DNA切割成片段并且将所述片段连接至芯片上的接头；并且通过PCR扩增来扩增由此获得的DNA。

【技术实现步骤摘要】
相互参照本申请要求2015年8月13日提交的美国临时专利申请号62/204,943的权益，所述专利申请全部以引用方式并入本文。本专利技术的背景DNA测序的策略可分组成多个类别。(Shendure,J.等人,“Advancedsequencingtechnologies:methodsandgoals,”Nat.Rev.Genet.,5(5):335-44,2004)。其包括(i)微电泳方法、(ii)通过杂交来测序、(iii)单一分子的实时观察，和(iv)环状阵列测序。可获得的市售产品包括454测序(用于454GenomeSequencers,RocheAppliedScience；Basel中)、Solexa技术(用于Illumina(SanDiego)GenomeAnalyzer中)、SOLiD平台(AppliedBiosystems；FosterCity,CA,USA)、Polonator(Dover/Harvard)和HeliScopeSingleMoleculeSequencer技术(Helicos；Cambridge,MA,USA)。这些测序技术的一个共性是从生物样品产生文库。文库制备通过DNA样品的随机片段化，随后体外连接共同接头序列来完成。此外，这些方法的共同点是从文库中的任何给定单一片段化DNA分子产生的PCR扩增子最终在空间上聚集至平面基底上的单一位置(例如，原位聚合酶克隆、桥PCR)，或微米尺度珠粒的表面(例如，乳液PCR)。新的测序方法，通常被称为下一代测序(NGS)技术，可经由测序技术来提供关于生物样品的快速、廉价和精确基因组信息。举例来说，高通量NGS(HT-NGS)方法可允许科学家以更大速度、较低成本并且以可接受的错误率来获得所需测序信息。NGS的一个预先步骤是以适合于NGS技术的方式来制备生物样品的核酸文库，例如，具有条形码的短序列文库。因此，出于测序目的，需要发现构建条形码文库的新方法。专利技术概述本公开提供构建条形码核酸文库的方法和系统。举例来说，本公开总体上提供制备条形码测序文库的方法和系统。这类文库可适用于使用NGS的方法。如本文描述所产生的测序文库依赖于芯片上的Y-接头、消失和出现限制位点、酶的混合物和PCR循环。本公开的方面提供从核酸构建文库的方法，方法包含：将核酸的至少一个拷贝安置于连接有多个接头的表面上；将溶液施加至表面，溶液包含：能够将核酸消化成多个核酸片段的第一限制酶；能够将一个核酸片段的末端与一个接头连接的连接酶；和能够消化多个接头之中的自身连接接头的第二限制酶；并且形成第一文库，第一文库包含多个连接核酸片段，所述核酸片段具有一个接头连接至其每个末端。在本文提供方面的一些实施方案中，将核酸的至少一个拷贝安置于表面上的步骤包含将核酸的至少一个拷贝在表面上延伸。在本文提供方面的一些实施方案中，表面包含丙烯酰胺凝胶。在本文提供方面的一些实施方案中，表面是固体支撑物。在本文提供方面的一些实施方案中，每个Y形接头是部分双链Y形寡核苷酸接头，所述接头包含第一可连接末端，和包含两个非互补链的第二未配对末端，其中非互补链的长度是至少约8个核苷酸。在本文提供方面的一些实施方案中，多个接头包含多个第一接头和多个第二接头，其中第一接头和第二接头不同。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶的浓度高于溶液中的连接酶的浓度。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶的浓度是连接酶浓度的至少两倍。在本文提供方面的一些实施方案中，连接核酸片段不超过600个碱基对长度。在本文提供方面的一些实施方案中，连接核酸片段不超过400个碱基对长度。在本文提供方面的一些实施方案中，自身连接接头在自身连接之后包含第二限制酶的限制位点。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶是II型限制性核酸内切酶。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶识别4个碱基对限制位点、5个碱基对限制位点或6个碱基对限制位点。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶识别4个碱基对限制位点。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶是MspA1I限制性核酸内切酶、PsiI限制性核酸内切酶或Alu1限制性核酸内切酶。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶是Alu1限制性核酸内切酶。在本文提供方面的一些实施方案中，连接酶是T4连接酶。在本文提供方面的一些实施方案中，第二限制酶识别至少8个碱基对长度的限制位点。在本文提供方面的一些实施方案中，与第二限制酶相比，第一限制酶识别限制位点的较短序列。在本文提供方面的一些实施方案中，第二限制酶是Pme1限制性核酸内切酶。在本文提供方面的一些实施方案中，方法进一步包含扩增第一文库，从而产生扩增连接核酸片段的第二文库。在本文提供方面的一些实施方案中，接头包括充当分子条形码的序列节段。在本文提供方面的一些实施方案中，每个接头具有识别接头在表面上的位置的独特分子条形码，并且其中分子条形码作为连接核酸片段的一部分包含在内。在本文提供方面的一些实施方案中，接头包含由第二限制酶的限制位点的一半组成的可连接末端。在本文提供方面的一些实施方案中，连接核酸片段不包括第一限制酶或第二限制酶的限制位点。本公开的另一个方面提供从核酸来构建文库的系统，系统包含：连接有多个接头的表面；能够将核酸消化成多个核酸片段的第一限制酶；能够将一个核酸片段的末端与一个接头连接的连接酶；和能够消化多个接头之中的自身连接接头的第二限制酶。在本文提供方面的一些实施方案中，多个接头是Y形接头。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶的浓度大于连接酶的浓度。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶是II型限制性核酸内切酶。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶识别4个碱基对限制位点、5个碱基对限制位点或6个碱基对限制位点。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶识别4个碱基对限制位点。在本文提供方面的一些实施方案中，与第二限制酶相比，第一限制酶识别限制位点的较短序列。在本文提供方面的一些实施方案中，第一限制酶是MspA1I限制性核酸内切酶、PsiI限制性核酸内切酶或Alu1限制性核酸内切酶。在本文提供方面的一些实施方案中，连接酶是T4连接酶。在本文提供方面的一些实施方案中，第二限制酶是Pme1限制性核酸内切酶。在本文提供方面的一些实施方案中，接头包括充当分子条形码的序列节段。在本文提供方面的一些实施方案中，每个接头具有识别接头在表面上的位置的独特分子条形码。在本文提供方面的一些实施方案中，接头包含由第二限制酶的限制位点的一半组成的可连接末端。本公开的其他方面和优势从以下详细说明变得容易为本领域技术人员显而易知，其中仅示出并描述本公开的例示性实施方案。如认识到，本公开能够执行其他和不同实施方案，并且其多个细节能够在各种明显方面加以修改，而都不背离本公开。因此，附图和说明书在本质上视为例示性，并且不是限制性的。以引用方式并入本说明书中提到的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，引用程度如同已明确且个别地指示将各个别公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文一般。附图简述本专利技术的特征和优势的更好理解参考阐明利用本专利技术原则的例示性实施方案的以下详细说明和附图来获得，在附图中：图1示出根据本公开的使用消失和出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从核酸构建文库的方法，所述方法包含：a)将核酸的至少一个拷贝安置于表面上，所述表面连接有多个接头；b)将溶液施加至所述表面，所述溶液包含：i.第一限制酶，所述第一限制酶能够将所述核酸消化成多个核酸片段；ii.连接酶，所述连接酶能够将所述核酸片段中的一个的末端与所述接头中的一个连接；和iii.第二限制酶，所述第二限制酶能够消化所述多个接头之中的自身连接接头；并且c)形成第一文库，所述第一文库包含多个连接核酸片段，所述核酸片段具有所述接头中的一个连接至其每个末端。

【技术特征摘要】
2015.08.13 US 62/204,9431.一种用于从核酸构建文库的方法，所述方法包含：a)将核酸的至少一个拷贝安置于表面上，所述表面连接有多个接头；b)将溶液施加至所述表面，所述溶液包含：i.第一限制酶，所述第一限制酶能够将所述核酸消化成多个核酸片段；ii.连接酶，所述连接酶能够将所述核酸片段中的一个的末端与所述接头中的一个连接；和iii.第二限制酶，所述第二限制酶能够消化所述多个接头之中的自身连接接头；并且c)形成第一文库，所述第一文库包含多个连接核酸片段，所述核酸片段具有所述接头中的一个连接至其每个末端。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一限制酶的浓度高于所述溶液中的所述连接酶的浓度。3.如权利要求1所述的方法，其中所述自身连接接头在所述自身连接之后包含用于所述第二限制酶的限制位点。4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一限制酶识别4个碱基对限制位点、5个碱基对限制位点或6个碱基对限制位点。5.如权利要求1所述的方法，其中所述第二限制酶识别至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾斯汀·科斯塔，
申请(专利权)人：生捷科技控股公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛;KY