花姬蛙抗氧化肽及其基因和在制药中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种活性多肽及其基因和在制药中的应用，所述的花姬蛙抗氧化肽是由12个氨基酸组成的环肽，分子量1334.91道尔顿，等电点8.002，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸形成分子内二硫键。所述花姬蛙抗氧化肽的基因序列由SEQ ID NO.4组成，其中编码有功能的成熟花姬蛙抗氧化肽是第187‑222位核苷酸。本发明专利技术由花姬蛙抗氧化肽的基因推导其成熟功能多肽氨基酸序列，合成的花姬蛙抗氧化肽具有很强的红细胞凝集和抗氧化功能。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种从动物组织得到的蛋白以及在生物制药中的用途。
技术介绍
：生物分子的氧化是一个自由基介导的过程，它对食品和生物系统会造成许多不利的影响。在好氧器官内，与动脉硬化、癌症等多种疾病相关的游离自由基不可避免的随着氧代谢的过程而产生。另外，氧化应激被认为与多种疾病例如老年痴呆症、帕金森氏症，这此病理系引发于糖尿病、由糖尿病引起的并发症、类风湿性关节炎和肌萎缩性脊髓侧索硬化症引发的神经退行性变有关(FoodChemistry,2008,107,1485–1493)。在食品中，营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品营养价值，造成食品品质的下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体疾病(JournalofFoodScience,1999,64,1000–1004)。因此寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于BHT、BHA和没食子酸丙酯等化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此被广泛应用于食品行业中，但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官有积蓄性致癌左右，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始慢慢限制起在食品中的使用，于是让人们把目光转向天然的抗氧化剂(FoodProcessing,1993,12,54–56)。α-生育酚是一种普遍适用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但却不利于食品保存。因此有必要寻找其他来源的天然抗氧化剂。由于两栖动物居住环境的特殊性，他们有时会受到自由氧等损害，这些活性自由氧能通过氧化脂肪、变性蛋白、破坏核酸，导致对代谢的严重后果和对组织和细胞的大量破坏。为了抵消这种氧化损害生存下来，两栖动物已经进化形成了抗氧化防御系统，抗氧化多肽是其中的一类重要组分。目前，从R.pleuraden、R.catesbeiana、O.livida等物种中鉴定了是十几中具有抗氧化活性的多肽(ChemRev.2015,115(4):1760-1846)。因此，两栖动物皮肤是天然抗氧化多肽的重要来源。能作为药物递呈的载体的凝集素已经被研究了几十年，很少从两栖动物皮肤中被鉴定，但是具有海藻糖结合活性的odorranalectin已经从O.grahami皮肤中被鉴定(PLoSOne.2008,3(6):e2381)，意味着两栖动物皮肤也是凝集素的重要来源。中国博大的多物种天然生物资源是结构多样性小分子有机化合物的重要来源，其中一些生物活性物质早已被中医记载和采用。很多两栖类动物作为中国传统中药和民族药物而广泛应用，如，花姬蛙(Microhylapulchra)是传统中药材，其成体被白酒内浸泡或加酒捣敷后能用于治疗骨折、腰痛、风湿痹痛、体弱无力、跌打损伤、疮痈溃后化脓和久不封口等多种病症。但是由于花姬蛙个体小和捕捉困难，目前对其皮肤药理活性物质的结构与功能研究在世界范围内还未见报道，其作为中药疗效的物质基础仍不为人们所知。进入21世纪以来，基因组学的飞速发展及合成生物学的兴起大大促进了天然产物的结构与功能研究；本专利技术利用基因组学方法和药理学研究获得花姬蛙抗氧化肽编码基因，专利技术人将本专利技术的花姬蛙抗氧化肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。专利技术人将本专利技术的花姬蛙抗氧化肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较未发现有任何相同的多肽。
技术实现思路
：本专利技术的目的是基于上述技术背景，针对天然抗氧化剂的不足和人工合成抗氧化剂的安全性问题，提供一种新的具有抗氧化和红细胞凝集活性的花姬蛙抗氧化肽及其基因和它在制备抗氧化功效的药物和食品添加剂中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种花姬蛙抗氧化肽，所述花姬蛙抗氧化肽的序列如SEQIDNo.1所示。KTCVYLPLPICSSEQIDNO.1一种花姬蛙抗氧化肽，所述的花姬蛙抗氧化肽是由12个氨基酸组成的多肽，分子量1334.91道尔顿，等电点8.002，其氨基酸序列为：LysThrCysValTyrLeuProLeuProIleCysSer(KTCVYLPLPICS)(SEQIDNO.1)，上述多肽的第三位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸形成分子内二硫键。所述花姬蛙抗氧化肽的编码基因由225个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为其序列为(SEQIDNO.4)：SEQIDNO.4序列中第187-222位核苷酸编码具有功能的成熟花姬蛙抗氧化肽。一种编码上述的花姬蛙抗氧化肽的核苷酸。所述花姬蛙抗氧化肽可在制备抗氧化功效的药物和食品添加剂中的应用。所述花姬蛙抗氧化肽在制备在制备清除自由基药物或美容用品中的用途。所述花姬蛙抗氧化肽在制备预防或治疗与胃炎或胰腺炎的药物中的用途，优选，所述胃炎或胰腺炎为炎症相关的胃炎或炎症相关的胰腺炎。所述花姬蛙抗氧化肽在制备靶向药物载体中的用途。所述花姬蛙在制备治疗神经退行性疾病的药物的用途，优选神经退行性疾病为治疗帕金森病。本专利技术的有益效果在于:由花姬蛙抗氧化肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的花姬蛙抗氧化肽具有显著的红细胞凝集和抗氧化作用。该花姬蛙抗氧化肽具有结构简单、人工合成方便、毒性低的有益特点。附图说明：图1为本专利技术花姬蛙抗氧化肽HPLC纯化鉴定结果；图2为本专利技术花姬蛙抗氧化肽质谱鉴定结果；图3为本专利技术花姬蛙抗氧化肽清除DPPH和ABTS自由基“量-效”关系曲线；图4为本专利技术花姬蛙抗氧化肽凝集红细胞结果。具体实施方式：下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：本专利技术的花姬蛙抗氧化肽，所述的花姬蛙抗氧化肽由12个氨基酸组成的环肽，分子量1334.91道尔顿，等电点8.002，其氨基酸序列为：LysThrCysValTyrLeuProLeuProIleCysSer(KTCVYLPLPICS)(SEQIDNO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸形成分子内二硫键。所述花姬蛙抗氧化肽的基因序列SEQIDNO.4的第187-222位核苷酸编码。本专利技术的花姬蛙抗氧化肽及其基因的制备过程包括如下步骤：实施例1，花姬蛙抗氧化肽基因克隆：I、花姬蛙皮肤总RNA提取：活体花姬蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4h，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10m1总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20m1玻璃匀浆器中匀浆30min。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃除沉淀。向上清中加入等体积的异丙醇，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即为花姬蛙皮肤总RNA。II、花姬蛙皮肤mRNA的纯化：花姬蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolationSystems试剂盒。具体如下：取花姬蛙皮肤总RNA500μg溶于500μlDEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μlOligo(dT)探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30S，弃上清，加0.5×SSC0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花姬蛙抗氧化肽，所述花姬蛙抗氧化肽的序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种花姬蛙抗氧化肽，所述花姬蛙抗氧化肽的序列如SEQIDNo.1所示。2.一种花姬蛙抗氧化肽，其特征在于，所述的花姬蛙抗氧化肽是由12个氨基酸组成的多肽，分子量1334.91道尔顿，等电点8.002，其氨基酸序列为：LysThrCysValTyrLeuProLeuProIleCysSer(KTCVYLPLPICS)(SEQIDNO.1)，上述多肽的第三位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸形成分子内二硫键。3.花姬蛙抗氧化肽基因的核苷酸序列，其特征在于：cDNA由225个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列如SEQIDNO.4所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐学清，陈新，曾白霜，张贝，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44