一种精确测定菊花花药开裂程度的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种精确测定切花菊花药开裂程度的方法及其应用，属于菊花遗传育种及生殖生物学领域。该方法包括：(1)获取待测样品的管状花，并对管状花进行解剖，获得花药鲜样，置于玻璃载玻片上；(2)将步骤(1)中的载玻片迅速置于显微镜下开始拍照和录像，然后滴加渗透液至花药鲜样上；(3)对步骤2)中花粉粒从开裂的花药中散出过程进行全程显微录像；(4)根据录像及照片，统计达到稳态后花药外花粉粒数，然后通过公式计算出花药开裂程度。本发明专利技术针对品种间散粉量、散粉速度差异极大的切花菊，提供了一种精确测定菊花花药开裂程度的方法，为研究菊花花药开裂程度遗传规律、发掘控制花药开裂程度的有关基因奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及菊花杂交育种、生殖生物学领域，该方法采用蒸馏水、蔗糖溶液、氯化钠溶液这三种不同渗透势的溶液滴入菊花单个花药之上，借助显微镜拍照、录像的方法，通过计算不同区域的花粉数来精确计算菊花花药的开裂程度。
技术介绍
菊花(Chrysanthemummorifolium)是一种重要的观赏植物，属中国十大传统名花和世界四大切花之一，其品种繁多，花色花形多变，观赏价值高。切花菊尤其是切花小菊因为其花色花型丰富、着花繁密、开花整齐及花期长等特点在世界切花生产中占有重要地位。但是切花小菊品种大量散粉时造成的花粉污染却降低了其观赏品质和观赏寿命，并且可能影响观赏者的呼吸道健康。在百合的商业化生产中，生产者会选择人工去除百合花药，此举虽然费时费力且会增加成本，但总体看来利大于弊。究其根本原因，百合花药去除较易且去除后不影响观赏价值。然而，菊花花序含有几十甚至上百个管状花，其数量庞大，加之尺寸微小且人工去雄不仅严重影响其观赏价值，而且操作起来非常困难，故人工去除菊花花药的方法不可行。因此，通过育种手段培育不散粉菊花新品种是解决菊花花粉污染的根本途径。菊花散粉量及花粉污染程度与其花药开裂程度密切相关，理论上花药开裂程度越大菊花散粉量就越大，花粉污染也就越严重。目前判断菊花花药开裂程度主要是通过主观观察法判断花药表面的花粉量或者通过计算散粉后的花药样品空腔面积占花药内腔总面积的比值来衡量花药开裂程度，这两种方法均存在一些不足之处。首先，对于第一种方法：主观性太强，不同观察者在观察同一品种同一发育时期花药表面花粉量时对花药开裂程度的判断经常存在差异。其次，菊花花药含花粉量对花药开裂程度的判断有较大影响，如两个菊花品种同一发育时期可能花药表面花粉量一样，主观观察法则认为这两个品种花药开裂程度一样；但如果这两个品种花药含花粉量不一样，那么通过主观观察法判断的结果则不正确。对于第二种方法：首先，各品种切花菊花药内花粉并非紧密地将花药内腔填充满，即花粉发育完全但未开裂的花药内本身就具有一定的空隙；其次，在不同品种的切花菊花药内，上述空隙面积也具有多态性，从而第二种方法所测值存在固有误差，而且也无法用于切花菊品种间花药开裂程度差异的精确评判。因此，有必要专利技术一种精确测定菊花花药开裂程度的方法，以加快推动不散粉菊花新品种培育的步伐。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种精确测定切花菊花药开裂程度的方法及其应用。首先，该方法用数值精确地对花药开裂程度进行量化，为进一步探索菊花花药开裂机制和遗传规律、及花药开裂关键基因的定位与挖掘奠定了坚实基础。其次，该方法可以检测到传统方法无法鉴别到的花药开裂点，并且可以检测到所有的开裂处，为进一步构建花药开裂的数理模型提供了重要基础。最后，该方法对花药样品不产生机械伤害，保证所测值的客观准确性。本专利技术的目的通过以下技术方案实现的：一种精确测定切花小菊花药开裂程度的方法，包括以下步骤：(1)获取待测样品的管状花，并对管状花进行解剖，获得花药鲜样，置于载玻片上；(2)将步骤(1)中的载玻片迅速置于显微镜下开始拍照和录像，然后滴加渗透液至花药鲜样上；(3)对步骤2)中花粉粒从开裂的花药中散出过程进行全程显微录像，达到稳态后拍照；(4)根据录像及照片，统计达到稳态后花药外花粉粒数，然后通过公式(I)计算出花药开裂程度；其中，Adl:花药开裂程度；Ot:花药外花粉粒数；M:该品种平均花药含粉量。该方法所测量的范围是取自发育成熟但顶部未破裂的管状花的花药，如附图1中3的全部的全部管状花的花药，或4、5中内轮未破裂的管状花的花药)花药，只需统计“花药外的花粉粒数”；对于取样自已经散粉或已经完成散粉的管状花(如：附图1中4、5的外轮已经破裂的管状花，或6中全部管状花)花药，则不适用于此方法。通过移液枪等精密微量液体转移设备精确滴加定量渗透液于花药鲜样上，所述的渗透液为去离子水、7.2％的蔗糖溶液或7.2％的NaCl溶液。研究表明优选去离子水为最佳渗透液。步骤(1)中所述对管状花进行解剖的过程为：用镊子轻轻夹着花药，让其固定住且镊子未使得管状花外壁发生凹陷变形；然后用解剖针在管状花头部纵切一刀，解剖针尖压住被切开的管状花切口的一端，再用镊子将被花药包围着的柱头取出置于载玻片上，用解剖针将柱头剔除，再将花药彼此分离并置于干净载玻片上，整个操作过程中不可撕裂花药壁。步骤(1)中每个载玻片上放置不超过5个花药鲜样。步骤(2)为对即将滴加渗透液液滴的花药鲜样进行显微拍照，拍摄其处理前的特写，物镜为10X/0.25；然后将物镜换成低倍镜(4X/0.10)，调节焦距及视野，使得相机获取的图像视野清晰明亮，花药处于视野中央，开始录像；10s后，滴加15μL渗透液于花药鲜样上。步骤(4)中达到稳态后，对液面区域进行拍照(低倍物镜4x/0.10)，由于整个液面区域面积较大，一般一个视野并不能包含整个液面区，因此要求拍摄多张照片且要求每张照片内散布的花粉成像清晰，若个别区域花粉密集，则采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄保证后续的花粉数目清点工作可以顺利进行；滴加液体前和达到稳态后的花药特写照片都采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄。步骤(4)中所述花粉粒的计数方法为：借助计算机或者具备触控功能的平板电脑设备清点拍摄的照片中散布到花药外的花粉粒数目得到Ot值。所述花粉粒计数方法的具体步骤为：同一花药的多张视野照片导入电脑设备，选择一张对焦清晰的照片，然后用鼠标或者触控笔对视野进行区域划分，分区域清点每个区域的花粉数目，计数过的花粉用鼠标或者触控笔点上一点以着色，以免混淆，最后累加所有区域花粉总数，得到该样品的Ot值。上述的方法在精确测定切花小菊花药开裂程度中的应用。本专利技术选择选取3个花药开裂程度不同的切花菊品种进行花药开裂程度的精确测定：a.以切花菊品种‘南农红橙’作为高散粉量、花药开裂程度高的品种样本；b.以切花菊品种‘南农红点点’为散粉量中等、花药开裂程度中等的品种样本；c.以切花菊品种‘Qx-115’为不散粉(花药内有花粉)、花药不开裂的品种样本；证明该方法为菊花花药开裂程度提供了精确的度量，且使用范围为高开裂程度至未开裂的花药。本专利技术精确测定切花小菊花药开裂程度的方法具体包括以下步骤：(1)在室温15℃，室内相对湿度为45％的无风实验室内，获取新鲜切花菊的待测管状花置于载玻片上，使用解剖针与镊子对管状花进行解剖：用镊子轻轻夹着花药，让其固定住即可，不可过分用力(不过分用力的标准是镊子未使得管状花外壁发生凹陷变形)；然后用解剖针在管状花头部纵切一刀，道口长度约为整个管状花长度的2/3；然后解剖针尖压住被切开的管状花切口的一端，再用镊子将为花药包围着的柱头取出置于载玻片上，用解剖针将柱头剔除，再将花药彼此分离并置于干净载玻片上。注意整个操作过程中不要撕裂花药壁。将单个花药鲜样均匀放置在干净载玻片(一般规格：25.6mm×76mm×1.2mm)上，一个载玻片上放置不超过5个花药。(2)对即将滴加渗透液液滴的花药鲜样进行显微拍照，拍摄其处理前的特写，物镜为10X/0.25。将物镜换成低倍镜(4X/0.10)，调节焦距及视野，使得相机获取的图像视野清晰明亮，花药处于视野中央，此时开始录像；10s后，用移液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种精确测定切花小菊花药开裂程度的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)获取待测样品的管状花，并对管状花进行解剖，获得花药鲜样，置于载玻片上；(2)将步骤(1)中的载玻片迅速置于显微镜下开始拍照和录像，然后滴加渗透液至花药鲜样上；(3)对步骤2)中花粉粒从开裂的花药中散出过程进行全程显微录像，达到稳态后拍照；(4)根据录像及照片，统计达到稳态后花药外花粉粒数，然后通过公式(I)计算出花药开裂程度；Adl=OtM×100%---(I)]]>其中，Adl:花药开裂程度；Ot:花药外花粉粒数；M:该品种平均花药含粉量。

【技术特征摘要】
1.一种精确测定切花小菊花药开裂程度的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)获取待测样品的管状花，并对管状花进行解剖，获得花药鲜样，置于载玻片上；(2)将步骤(1)中的载玻片迅速置于显微镜下开始拍照和录像，然后滴加渗透液至花药鲜样上；(3)对步骤2)中花粉粒从开裂的花药中散出过程进行全程显微录像，达到稳态后拍照；(4)根据录像及照片，统计达到稳态后花药外花粉粒数，然后通过公式(I)计算出花药开裂程度；Adl=OtM×100%---(I)]]>其中，Adl:花药开裂程度；Ot:花药外花粉粒数；M:该品种平均花药含粉量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过精密微量液体转移设备精确滴加定量渗透液于花药鲜样上，所述的渗透液为去离子水、7.2％的蔗糖溶液或7.2％的NaCl溶液；优选为去离子水。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对管状花进行解剖的过程为：用镊子轻轻夹着花药，让其固定住且镊子未使得管状花外壁发生凹陷变形；然后用解剖针在管状花头部纵切一刀，解剖针尖压住被切开的管状花切口的一端，再用镊子将被花药包围着的柱头取出置于载玻片上，用解剖针将柱头剔除，再将花药彼此分离并置于干净载玻片上，整个操作过程中不可撕裂花药壁。4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：每个载玻片上放置不超过5个花药鲜样。5.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕年军，华笠淳，张凤姣，费江松，廖园，陈发棣，房伟民，管志勇，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32