用于色素性视网膜炎的基因疗法制造技术

本文提供使用编码miR‑708的AAV颗粒治疗色素性视网膜炎的方法。在一个方面，将病毒颗粒施用至人受试者的眼部；例如，通过视网膜下注射。包含AAV5衣壳或其突变体的病毒颗粒在考虑之列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求保护2014年3月21日提交的美国临时申请系列号61/969,027的优先权利益，其在本文以其整体通过提述并入。序列表通过提述将如下以ASCII文本文件提交的内容整体并入本文：电脑可读形式(CRF)的序列表(文件名：159792010040SeqList.txt，记录日期：2015年3月17日，大小：63KB)。专利
本专利技术涉及AAV载体和使用AAV载体治疗色素性视网膜炎的方法。
技术实现思路
色素性视网膜炎(RP)是遗传性视网膜变性(inheritedretinaldegeneration)的最常见病因，其临床上的特征是夜盲症(nightblindness)和周边视觉(peripheralvision)的丧失。视杆色素视紫红质(rodvisualpigmentrhodopsin)公认为体染色体显性RP(ADRP)的最常见原因，尽管已经提出了许多针对视紫红质RP的治疗方法并在动物模型和临床研究中进行了测试，该疾病仍然无法治愈(Kalloniatis,M.等(2004)Clin.Exp.Optom.87(2):65-80)。许多数据支持这样的观点，即视紫红质RP是一种蛋白质错误折叠疾病，其中突变体蛋白的错误折叠或错误装配改变其细胞命运并诱发细胞死亡(Gregersen,N.等(2006)Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.7:103-24)。视紫红质基因中已知的RP突变包括无义和短小、读框内缺失突变，其中视紫红质基因在密码子23(P23H)处的单一碱基取代占美国全部显性色素性视网膜炎病例的～7％(Dryja,T.P.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(22):10177-81)。在培养的细胞中，与野生型(WT)蛋白不同，P23H突变体蛋白保留在ER中，这导致对未折叠蛋白质反应(unfoldedproteinresponse；UPR)的诱导、对蛋白酶体的抑制且突变体蛋白聚集成寡聚、高分子量形式(oligomeric,highmolecularweightspecies)，这种寡聚、高分子量形式形成胞内包含体(intracellularinclusion)(Saliba,R.S.等(2002)J.CellSci.115:2907-18)。类似地，P23H视紫红质错误定位和/或聚集在动物RP模型的视杆细胞中(Olsson,J.E.等(1992)Neuron9(5):815-30)，表明细胞培养物模型可以预测这种疾病的体内模型。需要的是一种缓解RP症状的手段。本文描述的专利技术提供用于治疗哺乳动物中色素性视网膜炎的方法，包括将包含编码miR-708的载体的重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus；rAAV)病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，本专利技术提供用于治疗色素性视网膜炎的方法，包括将包含第一rAAV载体的第一rAAV病毒颗粒和包含第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述第一rAAV载体包含编码miR-708的核酸，所述第二rAAV载体包含编码视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本专利技术提供用于治疗色素性视网膜炎的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述rAAV载体编码miR-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎包括减少或预防与色素性视网膜炎相关的症状。在一些实施方案或本专利技术中，治疗色素性视网膜炎的方法包括减少与RP有关的症状的方法，预防视网膜变性的方法，用于阻滞RP进展的方法，提高感光细胞功能的方法，等等。RP的症状和/或病理包括但不限于失明、夜间视觉丧失、周边视野损失、ERG功能丧失；视觉敏锐度和对比敏感度损失；视觉引导行为的丧失，视杆细胞功能下降，视杆细胞死亡，降低的暗视觉(scotopicvision)，视网膜细胞变化减少，感光细胞结构或功能的丧失；外核层(ONL)变薄或变厚；外网层(OPL)变薄或变厚；杆状和锥状外段的瓦解和之后的丧失(disorganizationfollowedbylossofrodandconeoutersegments)；杆状和锥状内段变短；双极细胞树突的回缩；视网膜内层包括内核层、内网层、神经节细胞(ganglioncell)层和神经纤维层的变薄或变厚；视蛋白错误定位；神经丝的过度表达；等等。在一些实施方案中，本专利技术提供预防视杆细胞功能退化和视杆细胞死亡和视锥细胞功能退化和视锥细胞死亡的方法。在一些方面，本专利技术提供治疗细胞中内质网(ER)应激的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。在一些实施方案中，所述哺乳动物患有或有风险罹患RP。在一些实施方案中，所述哺乳动物是患有RP或处于罹患RP的风险的人。在一些实施方案中，将所述rAAV颗粒施用至哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述细胞是眼细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞是感光细胞。在更进一步的实施方案中，所述细胞是视杆细胞。在一些实施方案中，所述方法包括减少ER应激的一种或多种细胞标记物。在进一步的实施方案中，所述ER应激的一种或多种细胞标记物是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。在一些实施方案中，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本专利技术提供用于治疗细胞中内质网(ER)应激的方法，包括将包含编码miR-708的核酸的第一rAAV载体和包含含有编码视紫红质的核酸的第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒施用至哺乳动物。在本专利技术的一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达miR-708。在进一步的实施方案中，所述启动子包括视紫红质激酶(RK)启动子或视蛋白启动子。在本专利技术的其他实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达视紫红质。在进一步的实施方案中，所述启动子包括RK启动子或视蛋白启动子。在一些实施方案中，本专利技术提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含rAAV载体的rAAV颗粒，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个RK启动子。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至第一RK启动子或第一视蛋白启动子，而所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二RK启动子或第二视蛋白启动子。在一些实施方案中，所述第一和/或第二视蛋白启动子包括MVM内含子(例如，SEQIDNO:23的内含子)。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)的方法，包括将包含腺相关病毒(rAAV)载体的重组rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述rAAV载体包含编码miR‑708的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.21 US 61/969,0271.一种用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)的方法，包括将包含腺相关病毒(rAAV)载体的重组rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。2.一种用于治疗哺乳动物细胞中的内质网(ER)应激的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。3.权利要求2的方法，其中将所述rAAV颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，任选地其中所述哺乳动物患有色素性视网膜炎或处于罹患色素性视网膜炎的风险。4.权利要求2或3的方法，其中所述细胞是眼细胞(ocularcell)。5.权利要求4的方法，其中所述细胞是感光细胞(photoreceptorcell)。6.权利要求5的方法，其中所述细胞是视杆细胞(rodphotoreceptorcell)。7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述方法包括减少ER应激的一种或多种细胞标记物。8.权利要求7的方法，其中所述ER应激的一种或多种细胞标记物是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质(rhodopsin)的核酸。10.权利要求1-8任一项的方法，进一步包括将包含第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述第二rAAV载体包含编码视紫红质(rhodopsin)的核酸。11.一种用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部或细胞，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸可操作地连接(operablylinked)至启动子。13.权利要求12的方法，其中所述启动子能够在感光细胞中表达miR-708。14.权利要求12或13的方法，其中所述启动子包含视紫红质激酶(RK)启动子或视蛋白启动子(opsinpromoter)。15.权利要求9-11任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。16.权利要求15的方法，其中所述启动子能够在感光细胞中表达视紫红质。17.权利要求15或16的方法，其中所述启动子包含RK启动子或视蛋白启动子。18.权利要求9的方法，其中i)所述编码miR-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个RK启动子；或ii)所述编码miR-708的核酸可操作地连接至第一RK启动子或第一视蛋白启动子，且所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二RK启动子或第二视蛋白启动子。19.权利要求18的方法，其中所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。20.权利要求18的方法，其中所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。21.权利要求12或15的方法，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。22.权利要求12-21任一项的方法，其中源自小鼠细小病毒(MVM)内含子的序列位于所述启动子的3’，其中任选地所述MVM内含子包含SEQIDNO:23的序列。23.权利要求12-22任一项的方法，其中所述启动子进一步包含：i)CMV增强子；ii)源自光感受器特异性转录因子的序列；iii)源自视杆细胞特异性转录因子的序列；iv)源自神经视网膜碱性拉链因子(zipperfactor)的序列；v)源自含视锥视杆同源框(conerodhomebox)的转录因子序列的序列；vi)CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；vii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子和视蛋白启动子(-500至+17)；viii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子、视蛋白启动子(-500至+17)和MVM内含子；ix)包含SEQIDNO:29的CMV增强子；x)包含SEQIDNO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子序列；xi)包含SEQIDNO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；xii)包含SEQIDNO:29的CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、包含SEQIDNO:30的源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、包含SEQIDNO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；xiii)包含SEQIDNO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQIDNO:29的CMV增强子和包含SEQIDNO:22的视蛋白启动子(-500至+17)；或xiv)包含SEQIDNO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQIDNO:29的CMV增强子、包含SEQIDNO:22的视蛋白启动子(-500至+17)和包含SEQIDNO:23的MVM内含子。24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸嵌入在内含子中。25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸包含内源性miR-708支架或miR-155支架。26.权利要求9-25任一项的方法，其中所述视紫红质是人视紫红质。27.权利要求9-26任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、插入或缺失。28.权利要求27的方法，其中所述取代、插入或缺失降低或防止miR-708进行的识别。29.权利要求9-28任一项的方法，其中所述视紫红质缺少3’非翻译区(UTR)miR-708靶序列。30.权利要求9-29任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、插入或缺失，其中所述miR-708靶序列是SEQIDNO:19。31.权利要求9-30任一项的方法，其中所述视紫红质的表达难以受到miR-708的抑制。32.权利要求1-31任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸包含SEQIDNO:1的核酸。33.权利要求1-31任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸包含与SEQIDNO:1具有约至少85％同一性的核酸。34.权利要求9-33任一项的方法，其中所述视紫红质包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。35.权利要求9-33任一项的方法，其中所述视紫红质包含与SEQIDNO:2具有约至少85％同一性的氨基酸序列。36.权利要求9-34任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含SEQIDNO:3的核酸。37.权利要求9-34任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含与SEQIDNO:3具有约85％同一性的核酸。38.权利要求1-8或10任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含SEQIDNO:5的多核苷酸。39.权利要求1-9或11任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26或SEQIDNO:27的多核苷酸。40.权利要求1-8或10任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQIDNO:5具有约至少85％同一性的多核苷酸。41.权利要求1-9或11任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26或SEQIDNO:27具有约至少85％同一性的多核苷酸。42.权利要求1-41任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒和/或所述第二AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAVDJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAVV708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳(capsid)rAAV2/HBoV1血清型衣壳。43.权利要求1-42任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒和/或所述第二AAV病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳。44.权利要求43的方法，其中所述rAAV病毒颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变体衣壳。45.权利要求1-44任一项的方法，其中所述rAAV载体和/或所述第二rAAV载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型反向末端重复序列(ITR)。46.权利要求45的方法，其中所述rAAV载体和/或所述第二rAAV载体包含AAV血清型2ITR。47.权利要求1-46任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同AAV血清型。48.权利要求1-46任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同AAV血清型。49.权利要求48的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5衣壳，并且其中所述载体包含AAV2ITR。50.权利要求48或49的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5酪氨酸突变体衣壳，且其中所述载体包含AAV2ITR。51.权利要求1-50任一项的方法，其中将所述rAAV颗粒注射入所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙(subretinalspace)。52.权利要求51的方法，其中将所述rAAV施用至所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙中超过一个位置。53.权利要求1-51任一项的方法，其中将所述rAAV颗粒玻璃体内注射至所述哺乳动物。54.权利要求1-53任一项的方法，其中至少10-30％的感光细胞由所述AAV转导。55.权利要求1-54任一项的方法，其中所述哺乳动物在内源视紫红质基因中具有突变。56.权利要求55的方法，其中所述内源视紫红质基因中的突变是体染色体(autosomal)显性突变。57.权利要求1或3-56任一项的方法，其中所述色素性视网膜炎是体染色体显性色素性视网膜炎或体染色体隐性色素性视网膜炎。58.权利要求1-59任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。59.权利要求58的方法，其中所述人具有在内源视紫红质基因中的P23H突变。60.权利要求10的方法，其中将编码miR-708的rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒同时施用至所述哺乳动物，或将编码miR-708的rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒顺序施用至所述哺乳动物。61.权利要求60的方法，其中首先将编码miR-708的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，其次再将编码视紫红质的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，或者首先将编码视紫红质的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，其次再将编码miR-708的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物。62.权利要求1-60任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒在药物组合物中，其中任选地所述药物组合物还包含药物上...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·奥赖尔登，M·亚当莫维兹，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：美国;US