基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于CD4+T细胞应答的幽门螺杆菌多亚单位疫苗及制备方法，该疫苗包含三种抗原，分别为次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、Ⅱ型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位；抗原还包括其同源蛋白。本发明专利技术的幽门螺杆菌疫苗基于CD4+T细胞免疫，CD4+T细胞应答在胃粘膜局部发挥了主要的抗H.pylori感染作用，其可以通过分泌细胞因子等途径，激发更为广泛的下游相关免疫细胞应答，在胃粘膜局部发挥更为广泛和有效的免疫保护作用。同时，本发明专利技术为多亚单位，免疫效果更加稳定有效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物
，涉及一种多亚单位疫苗，具体涉及一种基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗及制备方法。
技术介绍
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一种螺旋状的革兰阴性菌，定植于胃粘膜，与慢性胃炎、胃溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌等的发生密切相关。全球感染率超过50％，因此迫切需要一种有效的幽门螺杆菌疫苗。中国国家免疫工程技术研究中心开发的口服重组幽门螺杆菌疫苗为解决这一问题取得了重大突破。该疫苗的单一蛋白组分，尿素酶B亚单位(UreB)，是依据体液应答筛选而出。但是在开发过程中，并非H.pylori的每一个蛋白均被纳入筛选。三期临床试验显示，该疫苗第一年的保护率为71.8％(95％CI48.2～85.6)，第二年锐减到55.0％(95％CI0.9～81.0)。因而，其有效性和稳定性仍有待于进一步提高。现有幽门螺杆菌疫苗的开发基于抗体应答，并且为单亚单位疫苗。体液免疫对于抗幽门螺杆菌感染中具有一定的作用，而单靠体液免疫仍不足以彻底清除幽门螺杆菌。基于此设计的疫苗的保护效果并不理想。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗。本专利技术还提供了该种多亚单位疫苗的制备方法和应用。另外，本专利技术还提供了相应的一种基于CD4+T细胞免疫的引物组及其应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗，包含三种抗原，分别为次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(inosine5'-monophosphatedehydrogenase，IMPDH)、Ⅱ型柠檬酸合酶(typeⅡcitratesynthase，CSⅡ)和尿素酶B亚单位(ureasesubunitbeta，UreB)；所述抗原还包括其同源蛋白。优选的，三种抗原的质量比为1：1：1，疫苗总抗原含量为100μg。所述抗原的引物序列如下：次黄嘌呤核苷酸脱氢酶：上游引物：5'-CCGGAATTCATGAGAATTTTACAAAGGGCT-3'，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5'-CCGCTCGAGTTACCCATAATAATTAGGGGC-3'，如SEQIDNO.2所示。Ⅱ型柠檬酸合酶：上游引物：5'-CGCGGATCCATGTCTGTTACTTTA-3'，如SEQIDNO.3所示；下游引物：5'-CCGGAATTCTTAATCCCCTACATAG-3'，如SEQIDNO.4所示。尿素酶B亚单位：上游引物：5'-CCGGAATTCATGAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3'，如SEQIDNO.5所示；下游引物：5'-CCGCTCGAGCTTTTCTGCTAATCTTTTTCAT-3'，如SEQIDNO.6所示。优选的，所述疫苗还包含医学上可接受的免疫佐剂。进一步优选的，所述免疫佐剂为弗氏佐剂、铝佐剂、CPGODN1826或AddaVax中的任一种或几种。上述的一种基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)提取幽门螺杆菌DNA，利用次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、Ⅱ型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位的引物序列，经聚合酶链式反应(PCR)从幽门螺杆菌DNA中分别扩增，得相应的三个基因序列；2)构建表达载体和工程菌，分别诱导表达相应蛋白，纯化，得三种目的蛋白；3)利用步骤2)所得的三种目的蛋白以质量比1：1：1组成三亚单位疫苗，加入医学上可接受的佐剂进行乳化，即得。优选的，步骤1)中幽门螺杆菌DNA是利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。优选的，步骤1)中聚合酶链式反应的条件如下：1a)94℃，5分钟；1b)94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，1分钟；循环次数为30次；1c)72℃，10分钟。优选的，步骤2)中构建表达载体和工程菌的具体方法是：用OMEGA胶回收试剂盒回收目的基因序列，酶切目的基因及pGEX-6P-1质粒，用Takara公司的LigationMix试剂盒构建表达载体，而后依据转入BL21感受态细胞，构建工程菌E.Coli。优选的，步骤2)中的诱导表达条件是，采用1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)水溶液，诱导温度37℃，诱导时间3小时。优选的，步骤2)中的纯化方法包括步骤：2a)收集培养的细菌，裂解得上清；2b)加入1‰原菌液质量的GST填料，4℃摇晃过夜，使充分结合；2c)离心，弃上清，使用2～3倍填料体积的10mMol/LPBS洗涤2～3次；2d)在4℃条件下，PBS和填料的体积比为1：1，PrescissionProtease酶切过夜；2e)收集上清，即为目的蛋白。上述的一种基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。优选的，所述制剂为疫苗，其进一步优选为蛋白疫苗或核酸疫苗。一种基于CD4+T细胞免疫的引物组，包括三对引物：(A)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的引物，包括正向引物和反向引物，序列如下：上游引物：5'-CCGGAATTCATGAGAATTTTACAAAGGGCT-3'，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5'-CCGCTCGAGTTACCCATAATAATTAGGGGC-3'，如SEQIDNO.2所示。(B)Ⅱ型柠檬酸合酶的引物，包括正向引物和反向引物，序列如下：上游引物：5'-CGCGGATCCATGTCTGTTACTTTA-3'，如SEQIDNO.3所示；下游引物：5'-CCGGAATTCTTAATCCCCTACATAG-3'，如SEQIDNO.4所示。(C)尿素酶B亚单位的引物，包括正向引物和反向引物，序列如下：上游引物：5'-CCGGAATTCATGAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3'，如SEQIDNO.5所示；下游引物：5'-CCGCTCGAGCTTTTCTGCTAATCTTTTTCAT-3'，如SEQIDNO.6所示。上述引物组在制备幽门螺杆菌多亚单位疫苗中的应用。优选的，上述引物组在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的幽门螺杆菌疫苗基于CD4+T细胞免疫，CD4+T细胞应答在胃粘膜局部发挥了主要的抗H.pylori感染作用，其可以通过分泌细胞因子等途径，激发更为广泛的下游相关免疫细胞应答，在胃粘膜局部发挥更为广泛和有效的免疫保护作用。同时，本专利技术为多亚单位，免疫效果更加稳定有效。申请人基于th1和th17细胞应答，成功筛选出了3个保护性CD4+T细胞免疫优势抗原，IMPDH、CSⅡ和UreB。这三个抗原可以激发优势的CD4+T细胞应答。免疫攻毒保护实验也证实，分别用这三个抗原免疫，均发挥了明显的免疫保护效果。本专利技术三价亚单位疫苗在小鼠模型中进行了临床前研究。同时，通过该三价亚单位疫苗特异性CD4+T细胞过继实验，确认了CD4+T细胞在该三价亚单位疫苗中的保护功能，明确了保护机制。这为该新型三价亚单位疫苗的后期优化和临床研究提供了理论和实验基础。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为三种幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)保护性CD4+T细胞免疫优势抗原，I本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗，其特征在于，包含三种抗原，分别为次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、Ⅱ型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位；所述抗原还包括其同源蛋白。

【技术特征摘要】
1.基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗，其特征在于，包含三种抗原，分别为次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、Ⅱ型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位；所述抗原还包括其同源蛋白。2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌多亚单位疫苗，其特征在于，三种抗原的质量比为1：1：1，疫苗总抗原含量为100μg。3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌多亚单位疫苗，其特征在于，所述抗原的引物序列如下：次黄嘌呤核苷酸脱氢酶：上游引物：5'-CCGGAATTCATGAGAATTTTACAAAGGGCT-3'，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5'-CCGCTCGAGTTACCCATAATAATTAGGGGC-3'，如SEQIDNO.2所示。Ⅱ型柠檬酸合酶：上游引物：5'-CGCGGATCCATGTCTGTTACTTTA-3'，如SEQIDNO.3所示；下游引物：5'-CCGGAATTCTTAATCCCCTACATAG-3'，如SEQIDNO.4所示。尿素酶B亚单位：上游引物：5'-CCGGAATTCATGAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3'，如SEQIDNO.5所示；下游引物：5'-CCGCTCGAGCTTTTCTGCTAATCTTTTTCAT-3'，如SEQIDNO.6所示。4.权利要求1～3中任一项所述的幽门螺杆菌多亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取幽门螺杆菌DNA，利用次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、Ⅱ型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位的引物序列，经聚合酶链式反应从幽门螺杆菌DNA中分别扩增，得相应的三个基因序列；2)构建表达载体和工程菌，分别诱导表达相应蛋白，纯化，得三种目的蛋白；3)利用步骤2)所得的三种目的蛋白以质量比1：1：1组成三亚单位疫苗，加入医学上可接受的佐剂进行乳化，即得。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中构建表达载体和工程菌的具体方法是：用OMEGA胶回收试剂盒回收目的基因序列，酶切目的基因及pGEX-6P-1质粒，用Takara公司...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超，邹全明，孙合强，袁寒梅，赵卓，谭燃景，李滨，郭刚，章金勇，敬海明，秦溢，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50