本发明专利技术涉及一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，属于动物卫生检测技术领域，其特征在于，包括以下步骤：首先采集血清样品，采用“胰酶‑高铁酸钠‑过氧化氢‑聚乙二醇”方法处理血清样品，去除其中的非特异性凝血因子，得待检血清；采用倍比稀释的方法确定4个血凝单位的抗原浓度；在V型微量反应板上使待检血清、待检抗原和鸡红细胞悬液发生反应，以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清的最高稀释倍数作为血清抗体的效价，确定血清抗体效价为阳性的待检血清。本发明专利技术所述方法简单有效，成本低，可用于对数量较多的血清样品进行阳性率分析，为动物疾病治疗与预防奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物卫生检测
，具体地涉及一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法。
技术介绍
猪流感病毒（SwineInfluenzaVirus，SIV）在分类上属于正粘病毒科、A型流感病毒属，单股负链RNA病毒，基因组由大小不等的8个独立片段组成，能引起一种猪的三类动物疫病，H1N1、H3N2和H1N2亚型猪流感病毒是猪群中广泛存在并频繁引起猪群发病的毒株。单纯的SIV感染具有发病率高、死亡率低的特点，但猪流感是典型的免疫抑制性疾病，会引起其他病原的混合或继发感染，进而造成严重的经济损失。1918年西班牙大流感以后，流感病毒感染猪群演变为经典猪流感（H1/CS）分支，1976年欧洲H1N1亚型禽源流感病毒感染猪群，并逐渐替代CS分支，成为猪流感病毒主要分支，即欧亚类禽猪源流感病毒分支（H1/EA），中国香港在2001年首次分离到EA分支的流感病毒，另外H1和H3亚型季节性流感（HS）则在猪群中呈现明显的地域性分布。2009年从墨西哥爆发了席卷全球的流感大流行，并在中国猪群中广泛传播，通过遗传进化分析后表明猪源、人源和禽源流感病毒重组形成的新型流感病毒就是新爆发的pdm/09。猪的呼吸道上皮细胞具有同时表达α-2,3和α-2,6两种流感病毒的受体的能力，因而猪可同时感染人、猪和禽源流感病毒，普遍认为猪是流感病毒的“混合器”。中国猪群内呈现多种亚型流感病毒共存的现状，自pdm/09感染中国猪群后，pdm/09逐渐成为中国猪群内主要的流行分支，并开始在中国猪群中广泛存在。研究表明pdm/09已经与其它流感病毒发生重组，形成新型流感病毒，并开始在猪群中传播。所以加强猪群流感病毒的检测对公共卫生具有非常重要的意义，为此国内外学者对猪流感病毒的诊断与检测做了大量研究，研制出PCR、ELISA和Real-TimePCR等检测方法，但这些方法费事费力，需要昂贵的实验仪器和熟练的操作技能来完成，不适用于检测区域性猪流感病毒的分布情况，常用的也是最基本的检测区域性猪流感病毒分布情况的方法是血凝和血凝抑制试验，但由于动物血清中含有非特异性凝血因子，常造成结果的假阳性，对检测工作造成阻碍，另外由于检测工作量大，试验样本多，在结果数据的分析上，易造成紊乱。
技术实现思路
为了解决血凝和血凝抑制试验受非特异性凝血因子干扰以及数据分析难的问题，本专利技术拟提供一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，该方法简单有效、成本低廉，适用于地方性检测工作的开展。一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，包括以下步骤：步骤一、采集血清样品，按照不同地点将其分成不同组，对每组中的每份血清样品进行处理，处理步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μL的PBS溶液混合，得待检血清；取待检血清和体积分数为1%的鸡红细胞悬液，按照1:1的体积比将两者进行混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤；步骤二、在V型微量反应板的2-12孔中分别加入50μL的PBS溶液；在第1孔中加入100μL待检抗原，将其吸出50μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出50μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第11孔，弃最终的50μL；在第1至12孔中加入50μL的1%的鸡红细胞悬液，将V型微量反应板置于微量振荡器上处理1-2min，37℃静置15min，观察结果，获取待检抗原的血凝单位；步骤三、根据步骤二的结果配制浓度为4个血凝单位的待检抗原，在V型微量反应板的2-11孔中分别加入25μL的PBS溶液，第12孔加入50μL的PBS溶液；在第1孔加入50μL处理好的待检血清，将其吸出25μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出25μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第10孔，弃最终的25μL；在第1-11孔中分别加入25μL浓度为4个血凝单位的待检抗原，37℃静置30分钟，第1-12孔中分别加入50μL的1%的鸡红细胞悬液；以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清最高稀释倍数作为血清抗体的效价，血清抗体效价≥40时为阳性；步骤四、对步骤三获得的数据进行统计分析，比较不同组待检血清阳性率的差异是否显著。作为进一步的优化，步骤一中胰酶溶液的配制方法：在每0.8g胰酶中加入15mL的D-Hank’s液调制成糊状，再加入40mL的D-Hank’s液搅拌至完全溶解，定容至100mL，用碳酸氢钠溶液调pH至7.2，过滤灭菌，备用。作为进一步的优化，V型微量反应板在使用前进行清洗，清洗步骤为：将浸泡有75%乙醇的棉签置于V型微量反应板的每孔内旋转，然后用蒸馏水冲洗2遍，再用双蒸水洗涤3遍，置37℃温箱中干燥。作为进一步的优化，所述1%的鸡红细胞悬液是将3只SPF鸡的混合血液，加入到其2倍体积的Alsever液中，混合摇匀；500rpm/min水平离心5min，吸出上层的Alsever液和血球沉淀物表面的白细胞层，得血球沉淀物；加入血球沉淀物20倍体积的pH=7.2的生理盐水，混合均匀，1500rpm/min离心10min进行洗涤，吸出上清后再重复洗涤3次，取沉淀；将沉淀与生理盐水以1:100的体积比混合均匀，得1%的鸡红细胞悬液。有益效果：本专利技术采用胰酶、高铁酸钠、过氧化氢和聚乙二醇依次作用处理血清样品，其中，胰酶通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开。过氧化氢与高铁酸钠释放的原子氧作用不稳定非特异内源因子，使其趋于稳定，而高铁酸钠自身被还原，具有一定的絮凝效果，可将血清中残留的白细胞碎片和稳定的非特异性内源因子絮集，利用聚乙二醇的诱导作用，沉淀大分子物质，消除对红细胞凝集的影响，同时聚乙二醇使血清中各类物质处于疏散和活跃状态，为与鸡红细胞的反应创造了良好的环境，此方法简单有效、方便快捷，与常用非特异性凝集因子的去除方法相比，效果明显，凝集率降为0，消除了非特异性凝集因子的干扰。具体实施方式下面通过具体的实施方式对本专利技术做进一步的解释。一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，包括以下步骤：步骤一、采集血清样品，按照不同地点将其分成不同组，对每组中的每份血清样品进行处理，处理步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μL的磷酸盐缓冲液（即PBS溶液）混合，得待检血清；取待检血清和体积分数为1%的鸡红细胞悬液，按照1:1的体积比将两者进行混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤；其中，胰酶溶液的配制方法：在每0.8g胰酶中加入15mL的平衡盐溶液（即D-Hank’s液）调制成糊状，再加入40mL的D-Hank’s液搅拌至完全溶解，定容至10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、采集血清样品，按照不同地点将其分成不同组，对每组中的每份血清样品进行处理，处理步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL 8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL 2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL 体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μL的PBS溶液混合，得待检血清；取待检血清和体积分数为1%的鸡红细胞悬液，按照1:1的体积比将两者进行混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤；步骤二、在V型微量反应板的2‑12孔中分别加入50μL的PBS溶液；在第1孔中加入100μL待检抗原，将其吸出50μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出50μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第11孔，弃最终的50μL；在第1至12孔中加入50μL的1%的鸡红细胞悬液，将V型微量反应板置于微量振荡器上处理1‑2min，37℃静置15min，观察结果，获取待检抗原的血凝单位；步骤三、根据步骤二的结果配制浓度为4个血凝单位的待检抗原，在V型微量反应板的2‑11孔中分别加入25μL的PBS溶液，第12孔加入50μL的PBS溶液；在第1孔加入50μL处理好的待检血清，将其吸出25μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出25μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第10孔，弃最终的25μL；在第1‑11孔中分别加入25μL 浓度为4 个血凝单位的待检抗原，37℃静置30分钟，第1‑12孔中分别加入50μL的1%的鸡红细胞悬液；以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清最高稀释倍数作为血清抗体的效价，血清抗体效价≥40 时为阳性；步骤四、对步骤三获得的数据进行统计分析，比较不同组待检血清阳性率的差异是否显著。...
【技术特征摘要】
1.一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、采集血清样品，按照不同地点将其分成不同组，对每组中的每份血清样品进行处理，处理步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μL的PBS溶液混合，得待检血清；取待检血清和体积分数为1%的鸡红细胞悬液，按照1:1的体积比将两者进行混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤；步骤二、在V型微量反应板的2-12孔中分别加入50μL的PBS溶液；在第1孔中加入100μL待检抗原，将其吸出50μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出50μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第11孔，弃最终的50μL；在第1至12孔中加入50μL的1%的鸡红细胞悬液，将V型微量反应板置于微量振荡器上处理1-2min，37℃静置15min，观察结果，获取待检抗原的血凝单位；步骤三、根据步骤二的结果配制浓度为4个血凝单位的待检抗原，在V型微量反应板的2-11孔中分别加入25μL的PBS溶液，第12孔加入50μL的PBS溶液；在第1孔加入50μL处理好的待检血清，将其吸出25μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出25μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第10孔，弃最终的25μL；在第1-11孔中分别加入25μL浓度为4个血凝...
【专利技术属性】
技术研发人员：张桂红，甘平，曹振鹏，秦锋，马骏，卜德新，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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