一种EYFP基因标记根瘤菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种EYFP基因标记根瘤菌的方法，所述方法包括以下步骤：一、将EYFP‑pUC19载体酶切纯化后获得EYFP产物；二、将EYFP产物与载体pBBR1MCS‑2相连，酶切验证，将构建的EYFP‑pBBR1MCS‑2转入E.coli DH5α中；三、将供体菌EYFP‑pBBR1MCS‑2、辅助菌pRK2013、受体菌慢生型大豆根瘤菌三亲本杂交；四、同源重组：通过在KmR的平板上生长，筛选重组子；五、PCR验证，确定筛选的重组子已经插入到慢生型大豆根瘤菌的基因组中，而基因组中不含有野生株；六、显微镜下观察EYFP蛋白基因表达。本发明专利技术采用同源重组的方法，将EYFP与载体pBBR1MCS‑2连接，通过KmR抗性筛选重组子后，采用PCR法筛选突变株，确保插入染色中，使其稳定表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种EYFP基因标记根瘤菌的方法。
技术介绍
在荧光蛋白基因的实验过程中，通常将荧光蛋白基因与载体连接后导入受体菌中，由于慢生型大豆根瘤菌需要导入基因组中才可以表达，采用常规的方法很难使其有效表达，最终导致实验失败。
技术实现思路
为了解决EYFP基因导入慢生型大豆根瘤菌的技术问题，本专利技术提供了一种EYFP基因标记根瘤菌的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种EYFP基因标记根瘤菌的方法，包括以下步骤：一、将EYFP-pUC19载体酶切纯化后获得EYFP产物；二、将EYFP产物与载体pBBR1MCS-2相连，酶切验证，将构建的EYFP-pBBR1MCS-2转入E.coliDH5α中；三、将供体菌EYFP-pBBR1MCS-2、辅助菌pRK2013、受体菌慢生型大豆根瘤菌三亲本杂交；四、同源重组：通过在KmR的平板上生长，筛选重组子；五、PCR验证，确定筛选的重组子已经插入到慢生型大豆根瘤菌的基因组中，而基因组中不含有野生株；六、显微镜下观察EYFP蛋白基因表达。本专利技术采用同源重组的方法，将EYFP与载体pBBR1MCS-2连接，通过KmR抗性筛选重组子后，采用PCR法筛选突变株，确保插入染色中，使其稳定表达。附图说明图1是基因组DNA提取结果，M：DNAMarkerDL10000，1:HW-05基因组DNA；图2是酶切纯化后获得获得EYFP产物，M：DNAMarkerDL10000，1：EYFP基因酶切纯化产物；图3是EYFP-pBBR1MCS-2转化后提取结果，M：DNAMarkerDL10000，1:EYFP-pBBR1MCS-2连接后转化提取结果；图4是克隆酶切鉴定结果，M：DNAMarkerDL10000，1:克隆HindⅢ和BamHⅠ双酶切产物；图5是重组子筛选，M：DNAMarkerDL10000，1:EYFP片段PCR扩增产物。图6是EYFP基因在HW-05中表达。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。以慢生型大豆根瘤菌HW-05为例，本专利技术提供的EYFP基因标记根瘤菌的方法如下：一、试验方法1、HW-05的分离选取个大且饱满的根瘤，用剪刀将其剪下(带部分根)，将根瘤放在清水中浸泡4～5min，洗去杂质，再用95％乙醇浸泡5min后用0.1％的HgCl2表面灭菌5min，然后用无菌水冲洗10次。在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在YMA培养基上划线，在28℃的温箱中培养3～5d后，挑取少许菌体观察其形态、大小、透明度、粘稠度、颜色、光泽等特征与标准菌对比，将获得的菌体挑入培养基斜面上，继续培养观察，如果菌落无异常，再划线稀释反复分离，直到纯化为止。2、酶切纯化后获得EYFP产物；将西班牙塞维利亚大学赠予的EYFP-pUC19载体，采用限制性内切酶HindⅢ和BamHI进行双酶切，胶回收获得EYFP产物。双酶切体系(20μl)见表1：表13、纯化产物与pBBR1MCS-2连接将纯化的EYFP产物与载体pBBR1MCS-2在16℃连接过夜，反应体系如表2：表24、酶切鉴定限制性内切酶鉴定提取的质粒。根据pBBR1MCS-2载体酶切图谱，选用HindⅢ和BamHI双酶切筛选阳性重组质粒，反应条件为37℃水浴4h。反应结束后分别取3μL酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，观察酶切结果，确定是否有外源片段以及插入片段大小是否正确，从而初步判断是否为重组克隆。双酶切体系(20μl)见表1。5、EYFP基因转入HW-05重组子筛选通过同源重组，通过KmR筛选后进行PCR检测阳性克隆，在20μLPCR反应体系中，以1μL质粒DNA(经20倍稀释)为模板，加入相应的PCR反应成分，进行PCR扩增，电泳检测是否扩出特异性条带，以确定重组子。PCR体系(20μl)见表3：表3扩增反应参数见下表4：表4二、实验结果1、HW-05总DNA提取总DNA提取结果，根据总DNA提取方法获得基因组DNA，结果见图1。2、酶切纯化后获得EYFP产物；选用HindⅢ和BamHⅠ酶切质粒EYFP-pBBR1MCS-2，出现两个条带分别约为700bp和2.7kb，结果见图2。3、EYFP基因连接于pBBR1MCS-2载体及鉴定选择EYFP基因和pBBR1MCS-2载体共有的HindⅢ和BamHⅠ两种内切酶，进行酶切连接后转化，提取质粒，在约为6kb出现条带，结果见图3。选用HindⅢ和BamHⅠ酶切进行验证，出现两个条带分别约为700bp和5kb，结果见图4。4、EYFP转入pBBR1MCS-2重组子筛选将EYFP基因经三亲本杂交转入HW-05后，PCR扩增EYFP基因，条带约为700bp的为重组子，结果见图5。5、EYFP基因在HW-05中表达显微镜下观察，看到EYFP荧光出现，结果见图6。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EYFP基因标记根瘤菌的方法，其特征在于所述方法步骤如下：一、将EYFP‑pUC19载体酶切纯化后获得EYFP产物；二、将EYFP产物与载体pBBR1MCS‑2相连，酶切验证，将构建的EYFP‑pBBR1MCS‑2转入E.coli DH5α中；三、将供体菌EYFP‑pBBR1MCS‑2、辅助菌pRK2013、受体菌慢生型大豆根瘤菌三亲本杂交；四、同源重组：通过在KmR的平板上生长，筛选重组子；五、PCR验证，确定筛选的重组子已经插入到慢生型大豆根瘤菌的基因组中，而基因组中不含有野生株；六、显微镜下观察EYFP蛋白基因表达。

【技术特征摘要】
1.一种EYFP基因标记根瘤菌的方法，其特征在于所述方法步骤如下：一、将EYFP-pUC19载体酶切纯化后获得EYFP产物；二、将EYFP产物与载体pBBR1MCS-2相连，酶切验证，将构建的EYFP-pBBR1MCS-2转入E.coliDH5α中；三、将供体菌EYFP-pBBR1MCS-2、辅助菌pRK2013、受体菌慢生型大豆根瘤菌三亲本杂交；四、同源重组：通过在KmR的平板上生长，筛选重组子；五、PCR验证，确定筛选的重组子已经插入到慢生型大豆根瘤菌的基因组中，而基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：于徳水，甄涛，张先成，于盛竹，曲娟娟，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23