一种酯酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种酯酶基因的获得及其克隆表达与应用，属于生物工程领域。公开了其底物特性。该酯酶具有广泛的作用，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术克隆表达了一种酯酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
技术介绍
阿魏酸酯酶(Feruloylesterases，FAEs)又称肉桂酸酯酶，它是一种羧酸酯酶，是能水解阿魏酸甲酯、低聚糖酯酶和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放游离阿魏酸的酶。它能切断细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。在食品工业中，利用酯酶来降解植物细胞壁中的阿魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原材料通过酯酶的处理使细胞壁变得疏松，作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用，作为制浆造纸工业的原料可以减少制浆工序化化学药品的使用，减少污染，并有利于后续工序的进行。1987年，阿魏酸酯酶在Streptomycesolivochromogenes中被第一次发现。研究表明真菌、细菌、酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前发现的产酶微生物有黑曲霉(Aaspergillusniger)，链霉菌(Streptomycesavermitilis)，梭菌(Clostridiumthermocellum)，乳酸杆菌(Lactobacillisp.)，假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)等，但绝大多数阿魏酸酯酶是从真菌中分离出来的。研究发现一些乳酸杆菌有较强的阿酸酯酶活性，并且已经从中克隆表达出阿魏酸酯酶的基因(Wang,X.K.,etal.(2004).\PurificationandcharacterizationofaferuloylesterasefromtheintestinalbacteriumLactobacillusacidophilus.\ApplMicrobiolBiot70(4):2367-2372；BiochemicalPropertiesofTwoCinnamoylEsterasesPurifiedfromaLactobacillusjohnsoniiStrainIsolatedfromStoolSamplesofDiabetes-ResistantRats，ApplMicrobiolBiot，2009，5(15)，5018–5024；)。之前有报道芽孢杆菌也有阿魏酸酯酶活性(J.DonaghyáP.F.KellyáA.M.McKay(1998).\DetectionofferulicacidesteraseproductionbyBacillusspp.andlactobacilli.\ApplMicrobiolBiotechnol50:257-260)，但未有相关的基因及蛋白序列报道。我们在前面的三个专利(201610158987.9,201610154877.5,201610154846.X)中已经公布了解淀粉芽孢杆菌中的相关基因序列。本专利进一步公开了一株芽孢杆菌中的一种新型阿魏酸酯酶。与NCBI数据库比对发现，该酯酶与短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)中的假设的酯酶相似度最高。
技术实现思路
本专利技术从芽孢杆菌中克隆得到了一个新型的酯酶基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性。并用它进行了阿魏酸提取的应用。本专利技术的技术方案如下：1、菌株本专利技术酯酶基因的来源菌株为：Bacillussp.SYBChb4(由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号CCTCCNO:M2015018)。保藏日期是二零一五年一月七日；保藏地址是中国武汉武汉大学。2、酯酶基因的克隆提取Bacillussp.SYBChb4菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出酯酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。3、酯酶表达与纯化将重组质粒导入E.coliBL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。4、酯酶酶学性质以阿魏酸甲酯为底物研究pH对本专利技术所述酯酶酶活的影响。以阿魏酸甲酯为底物研究温度对本专利技术所述酯酶酶活的影响。以阿魏酸甲酯为底物测定了Ca2+、K+、Na+、Mn2+、Zn2+、Ni+、Co+、Cu2+、Mg2+、Fe2+等离子对酶活的影响。酯酶的底物特性分析：所用的底物有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯、乙酸乙烯酯、三甲基乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、正丁酸乙烯酯、巴豆酸乙烯酯、乙烯葵酸酯、月桂酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、乙酸香叶酯、乙酸苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、三-O-乙酰基-D葡萄烯糖、α-D(+)五乙酰葡萄糖、乳酸甲酯、己酸甲酯、辛酸甲酯、二氢茉莉酮酸甲酯、溴乙酸甲酯、2-溴丙酸甲酯、溴苯乙酸甲酯、甲基扁桃酸酯、(R)-(-)-扁桃酸甲酯、2，6-二羟基-4-甲基苯甲酸甲酯、4-硝基-苯基乙酸、4-硝基苯丁酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、咖啡酸乙酯、咖啡酸苯乙酯、对香豆酸甲酯、绿原酸、肉桂酸卞酯。酶活测定方法为：20mM磷酸缓冲液，20ug/ml冷冻干燥的纯酶，1mM底物，水浴控温反应30min，沸水浴100℃加热3分钟终止反应。用高效液相色谱检测底物减少量，高效液相色谱检测条件为：0-15min10-100％乙腈、90-0％水(0.1％甲酸)；15-20min100％乙腈、0水；20-30min10％乙腈、90％水(0.1％甲酸)，检测器为Alltech3300型蒸发光散射检测器。温度、pH、离子、底物的影响均采用该体系。5.研究该脂酶对自然底物去淀粉麸皮的活性。去淀粉麸皮按照文献的方法制备(Xylan-hydrolysingenzymesfromStreptomycesspp.EnzymeMicrobTech，1988，10(7):403–409.)。麸皮中阿魏酸的总量以碱法提取得到的阿魏酸计算(Preparationofferμlicacidfromagricμlturalwastes:Itsimprovedextractionandpurification.JournalofAgricμlturalandFoodChemistry，2008，56(17):7644–7648.)。阿魏酸释放率为阿魏酸的酶解释放量占碱提取的阿魏酸总量的百分率具体实施方式实施例1本实施例为本专利技术所述酯酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。1、Bacillussp.SYBChb4DNA的提取将Bacillussp.SYBChb4菌株在LB培养基中培养12小时，12,000rmp/min离心10分钟得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取Bacillussp.SYBChb4菌体基因组总DNA，放冰箱备用。2、大肠杆菌感受态制备(1)接种E.coliDH5α和BL21(DE3)分别于含有20mLLB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。(2)按1％接种量接种于50mLLB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/LC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于芽孢杆菌的酯酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于芽孢杆菌的酯酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的酯酶，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，王小梅，陈佳君，廖祥儒，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32