一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法技术

本发明专利技术公开一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法。该方法是在不需要选择性激发供体和受体，而且也不需要选择性收集探测供体和受体荧光的情况下实现快速FRET定量成像检测。因此，该方法对仪器的配置要求不高，成本低，而且测量过程只需要切换一次激发光，因而具有能够快速实时动态测量的优点，可实现毫秒时间尺度的快速FRET定量显微成像检测。因此，本发明专利技术对于活细胞FRET定量实时动态检测具有重要的应用价值，必将极大地推动FRET定量检测技术在细胞生物学中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及荧光共振能量转移效率的测量方法，具体涉及一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移(FRET)效率(E)的快速测量方法。
技术介绍
荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET)是指两个荧光基团足够靠近时，处于激发态的供体荧光团将能量以非辐射形式转给邻近受体荧光团的过程。FRET发生需要满足三个条件：(1)供受体之间的距离小于10nm；(2)供体偶极子与受体偶极子的取向不能相互垂直；(3)供体的发射光谱与受体的激发光谱有重叠且重叠率大于30％。供受体之间的FRET效应一般采用FRET效率(E)来表征。E为供体吸收能量后转移给受体的能量所占的百分比，其高度依赖供体受体分子之间的距离r，可表示为：其中R0(半径)是指E为50％时，供体与受体之间的距离。R0与供体的发射光谱、受体的吸收光谱、供体的量子产率、受体的消光系数及介质的折射率和供体分子与受体分子空间取向有关。目前主要的FRET定量成像方法包括：荧光寿命成像法(FluorescenceLifetimeImagingMicroscopy，FLIM)：通过测量受体存在和不存在时的供体分子的荧光寿命τD和τDA来得到E＝1-τDA/τD(Jares-ErijmanEA.&JovinTM.FRETimaging[J].NatBiotechnol.2003,21(11):1387-1395)。虽然FLIM测量结果准确，但是需要选择性地探测供体荧光(ZalT.&GascoigneNR.Photobleaching-correctedFRETefficiencyimagingoflivecells[J].BiophysJ.2004,86(6):3923-3939)，而且一般需要较长的测量时间,因而无法用于实时检测活细胞中的快速动态变化过程。基于受体光漂白方法(photobleachingFRET，pbFRET)：通过探测受体漂白前后供体通道荧光强度的变化来得到FRET效率(KenworthyA.K.Imagingprotein-proteininteractionsusingfluorescenceresonanceenergytransfermicroscopy[J].Meth.2001,24(3):289-296)(YuHN.,ZhangJW.,LiHL.,QuJL.&ChenTS.(2012)Anempiricalquantitativefluorescenceresonanceenergytransfermethodformultipleacceptorsbasedonpartialacceptorphotobleaching.Appl.Phys.Lett.100,253701)。该方法需要供体通道选择性地探测供体荧光。虽然pbFRET方法是最为直接的FRET定量检测方法，但是光漂白受体会对细胞造成一定的损伤，同时也需要较长的时间。因此，pbFRET方法不适合在单细胞中进行多次测量，也不能在活细胞中进行实时动态监测。基于光谱分离的FRET成像法(Spectralunmixing-basedFRETimaging)：基本思想是通过线性分离出FRET样本光谱中的供体荧光、受体直接激发荧光和受体敏化荧光的相对占比权重从而得到样本的FRET效率(ThalerC.,KoushikS.V.,BlankP.S.&VogelS.S.Quantitativemultiphotonspectralimaginganditsuseformeasuringresonanceenergytransfer[J].Biophys.J.2005,89(4):2736-2749)。(MustafaS.etal.Quantitativeresonanceenergytransferefficiencymeasurementsusingsimultaneousspectralunmixingofexcitationandemissionspectra[J].J.Biomed.Opt.2013,18(2):026024)(LiliZhang,GuiqiQin,LiuyingChai,JiangZhang,FangfangYang,HongqinYang,ShusenXie,TongshengChen*.Spectralwide-fieldmicroscopicFRETimaginginlivecells.J.Biomed.Opt，2015，20(8).086011)。由于光谱扫描成像需要较长时间，因此很难实现快速实时测量。3-cubes强度测量方法(E-FRET)：三个荧光图像是通过3个不同的荧光滤光片组合(cube)获取，即供体通道成像(IDD，供体光激发在供体通道上探测到的荧光强度)，FRET通道成像(IDA，供体光激发在受体通道上探测到的荧光强度)，受体通道成像(IAA，受体光激发在受体通道上探测到的荧光强度)。该方法需要增加额外的参考样本对系统进行校正，并且需要在恒定的仪器参数状态下进行所有的检测(ZalT,GascoigneNR.Photobleaching-correctedFRETefficiencyimagingoflivecells[J].Biophysicaljournal,2004,86(6):3923-3939)。另外，该方法要求供体通道选择性探测到供体荧光，受体激发光必须选择性激发受体。因此，该方法的实际测量难度很大(SeitzA.,TerjungS.,ZimmermannT.&PepperkokR.Quantifyingtheinfluenceofyellowfluorescentproteinphotoconnersiononacceptorphoyobleaching-basedfluorescenceresonanceenergytransfermeasurements[J].JBiomOpt.201217(1)011010)。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法。该方法是在不需要选择性激发供体和受体，而且也不需要选择性收集探测供体和受体荧光的情况下实现快速FRET显微定量动态成像检测。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术是基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移(FRET)效率(E)的快速测量，即是一种改进的双通道E-FRET(ZalT,GascoigneNR.Photobleaching-correctedFRETefficiencyimagingoflivecells[J].Biophysicaljournal,2004,86(6):3923-3939)快速测量方法。这种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移(FRET)效率(E)的快速测量方法，包括以下的具体步骤：(1)利用两种不同波段的激发光分别激发单供体样本并进行双通道同时荧光成像，分别得到和(上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，D表示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法，其特征在于包括以下的具体步骤：(1)利用两种不同波段的激发光分别激发单供体样本并进行双通道同时荧光成像，分别得到和通过如下公式得到供体的激发吸收比率系数vD和发射分布系数uD；vD=Iex1ϵD1Iex2ϵD2=Ij1(D)Ij2(D)---(1)]]>uD=I1i(D)I2i(D)---(2)]]>所述的和中的上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，D表示单转供体样本；(2)利用两种不同波段的激发光分别激发单受体样本并进行双通道同时荧光成像，分别得到和通过如下公式得到受体的激发吸收比率系数vA和发射分布系数uA；vA=Iex1ϵA1Iex2ϵA2=Ij1(A)Ij2(A)---(3)]]>uA=I1i(A)I2i(A)---(4)]]>所述的和中的上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，A表示单转受体样本；(3)利用供受体浓度比已知的串联质粒校正系统得到校正因子g；所述的校正因子g通过供受体浓度比为1:1的两种质粒来得到；或者通过已知效率的供受体浓度比为1:1的一种质粒得到；(4)待测FRET样本的FRET效率的测量：利用两种不同波段的激发光分别激发待测FRET样本并进行双通道同时荧光成像，得到和通过公式(5)计算得到和再通过公式(6)计算得到δ1和δ2，最后代入公式(9)计算得到待测FRET样本的表观FRET效率；uDAi=I1i(DA)I2i(DA)---(5)]]>δi=uD-uDAiuDAi-uA---(6)]]>EfD=δ1vD-δ2vAδ1vD-δ2vA+(vD-vA)·g---(9)]]>所述的和中的上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，DA表示待测FRET样本。...

【技术特征摘要】
1.一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法，其特征在于包括以下的具体步骤：(1)利用两种不同波段的激发光分别激发单供体样本并进行双通道同时荧光成像，分别得到和通过如下公式得到供体的激发吸收比率系数vD和发射分布系数uD；vD=Iex1ϵD1Iex2ϵD2=Ij1(D)Ij2(D)---(1)]]>uD=I1i(D)I2i(D)---(2)]]>所述的和中的上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，D表示单转供体样本；(2)利用两种不同波段的激发光分别激发单受体样本并进行双通道同时荧光成像，分别得到和通过如下公式得到受体的激发吸收比率系数vA和发射分布系数uA；vA=Iex1ϵA1Iex2ϵA2=Ij1(A)Ij2(A)---(3)]]>uA=I1i(A)I2i(A)---(4)]]>所述的和中的上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，A表示单转受体样本；(3)利用供受体浓度比已知的串联质粒校正系统得到校正因子g；所述的校正因子g通过供受体浓度比为1:1的两种质粒来得到；或者通过已知效率的供受体浓度比为1:1的一种质粒得到；(4)待测FRET样本的FRET效率的测量：利用两种不同波段的激发光分别激发待测FRET样本并进行双通道同时荧光成像，得到和通过公式(5)计算得到和再通过公式(6)计算得到δ1和δ2，最后代入公式(9)计算得到待测FRET样本的表观FRET效率；uDAi=I1i(DA)I2i(DA)---(5)]]>δi=uD-uDAiuDAi-uA---(6)]]>EfD=δ1vD-δ2vAδ1vD-δ2vA+(vD-vA)·g---(9)]]>所述的和中的上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，DA表示待测FRET样本。2.根据权利要求1所述的基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法，其特征在于：所述的通过供受体浓度比为1:1的两种质粒来得到校正因子g，是利用两种不同波段的激发光分别激发供受体浓度比为1:1的两种FRET参照样...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈同生，魏丽春，张江，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44