本发明专利技术提供本发明专利技术公开了一种基于气相色谱质谱联用(GC‑MS)研究聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉代谢组学的样品处理方法，通过发酵培养，获得发酵对数生长稳定期的菌体，先离心，除去发酵液中的CaCO3，再次离心，弃上清液获得菌体。用预冷的0.9%NaCl洗菌体2次，经过淬灭剂淬灭，液氮研磨，预冷的70%甲醇提取，冷冻干燥，衍生化等处理过程。将处理好的样品进行GC‑MS检测。本发明专利技术的有益效果是首先，该方法分析后可以检测到300多个物质，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸等不同类别的物质；其次，该方法提取得到的样品进行GC‑MS检测时峰形比较稳定，基线很平，峰的数量较多。因此综合考虑谱图的峰形、峰数、检索结果的匹配度等多方面因素，证明该方法适用于出芽短梗霉GC‑MS研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物机理研究领域，尤其是涉及出芽短梗霉的GC-MS代谢组学研究的样品处理方法。
技术介绍
聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物，具有优良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等独特性质，其次，它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的这些性质，使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物法合成聚苹果酸具有成本低、合成条件温和、产物的分子量相对较高等优点，因此生物法合成聚苹果酸具有很好的开发前景。出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)又名“茁霉”、“芽生侧茁霉”。出芽短梗霉形态特异，在发酵特点上与酵母菌细胞相似，又俗称“黑酵母”。出芽短梗霉在发酵过程中能合成胞外多聚糖、PMLA、酶、抗菌素、单细胞蛋白等多种产物。目前国内外有关出芽短梗霉合成聚苹果酸的研究越来越多，但多数集中在菌株筛选以及发酵条件的优化，目的是提高产量。有关发酵工艺的研究已经比较成熟且进入到瓶颈期，要想有所突破，还需从根本上解决问题。因此，对出芽短梗霉合成聚苹果酸的代谢过程以及合成机理进行研究具有深远的研究意义。本专利技术就是为这一工作做前期准备，通过对样品前处理的各个环节进行实验，建立一种适用出芽短梗霉的独特处理方法，为后期进行GC-MS研究提供理论依据。代谢物组学是无目的性、整体性地分析细胞对外界环境或细胞内变化做出响应机制的过程，主要针对单一细胞或生物在一定的生理条件下细胞内低分子量代谢物。代谢物组学结合高通量的代谢物检测与分离技术，对代谢物进行定性和定量分析。目前，代谢物组学分析技术主要采用色谱法、质谱法、红外光谱法、核磁共振等分离分析手段及其组合。气相色谱-质谱联用（GC-MS）由于其检测灵敏度高，精准度高，稳定性强，被广泛应用于代谢物组学的研究。目前，有许多研究是采用GC-MS方法进行酵母菌、三孢布拉氏霉菌等菌株的代谢物分析，但在出芽短梗霉研究领域没有相关的报道，由于不同的微生物在进行GC-MS研究时菌体结构不同，胞内物质也有差别，因此在进行细胞破壁、代谢物提取等环节不能均一化，所以建立一种适合出芽短梗霉代谢组学研究的特有处理方法对机理研究是至关重要的。
技术实现思路
本专利技术为解决以上问题，对这一方向进行了相关研究并建立了完整的方法。本专利技术的目的是提供一种出芽短梗霉的GC-MS代谢组学研究的样品处理方法，通过对菌体处理、样品提取、衍生化等几个环节进行实验，建立一种适合出芽短梗霉代谢组学研究的特有处理方法。结合实验室已成熟的完整发酵工艺，在发酵进入到稳定期时进行取样、菌体处理、代谢物提取和衍生等处理过程，为GC-MS检测制作样品。该方法为后续进一步进行出芽短梗霉代谢组学研究以及聚苹果酸合成机理的研究提供了理论依据和前期工作。本专利技术公开了一种基于气相色谱质谱联用(GC-MS)研究聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉代谢组学的样品处理方法，通过发酵培养，获得发酵对数生长稳定期的菌体，先离心（7000r/min，30s），除去发酵液中的CaCO3，再次离心（15000r/min，10min），弃上清液获得菌体。然后用预冷的0.9%NaCl洗菌体2次，经过淬灭剂淬灭，液氮研磨，预冷的70%甲醇提取，冷冻干燥，衍生化等处理过程。将处理好的样品进行GC-MS检测。本专利技术针对各个环节进行了研究，建立了一种适用于出芽短梗霉GC-MS研究中样品处理部分的特有方法。本专利技术提供的技术方案具体如下：一种出芽短梗霉的GC-MS代谢组学研究的样品处理方法，包括以下步骤：（1）通过发酵培养获得出芽短梗霉菌体1.1种子培养将出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用无菌生理盐水洗斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液。按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养；1.2发酵培养接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；在发酵稳定期即96h、120h、144h的任一时间点进行取样，获得发酵液立即进行处理；（由于进行筛选方法的研究不是机理研究实验，因此，任选一点进行取样即可）；（2）样品制备2.1样品前处理对不同时间点取得的发酵液进行处理，首先离心（7000r/min，30s），除去发酵液中的CaCO3，再次离心（15000r/min，10min），弃上清液获得菌体。然后用预冷的0.9%NaCl洗菌体两次，将菌体放入液氮中淬灭5-15min即可进行破壁处理；经过反复多次添加液氮进行研磨，研磨20-30min，称取研磨后的粉末150mg于1.5mL离心管中用于小分子代谢物的提取，提取时向液氮研磨后的样品加入1mL预冷的70%甲醇，反复冻融三次，冷冻离心（10000r/min，10min），取200μL上清液加入20μL1mg/mL的丁二酸作为内标，然后进行冷冻干燥；2.2衍生化将真空冷冻干燥后的样品，加50μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（20mg/mL），充分溶解样品，置于40℃水浴中，反应90min；加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均匀，置于40℃水浴中，反应90min；将衍生后的样品10000r/min冷冻离心10min；取上清液200μL加入进样瓶中，于室温放置2h，用于GC-MS检测；为了取得更好的技术效果，步骤（1）所述种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水。为了取得更好的技术效果，步骤（1）所述种子培养的条件为：培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。为了取得更好的技术效果，步骤（1）所述发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，CaCO320g/L，其余为蒸馏水。为了取得更好的技术效果，步骤（1）所述发酵培养的条件为：培养条件为转速300r/min，通风比1:2，罐压0.1Mpa，发酵周期为144h。本专利技术所用菌种来源：天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法，申请号:200910071171.2。该专利中公开了本专利技术所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC3337。本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术针对出芽短梗霉GC-MS样品处理的收集菌体、破壁提取胞内物质、提取物质、衍生化等环节进行了大量单因素实验，通过优化建立了一种适用于出芽短梗霉气相质谱研究的方法。采用已建立方法进行GC-MS检测和分析时发现：首先，该方法分析后可以检测到300多个物质，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸等不同类别的物质；其次，该方法提取得到的样品进行GC-MS检测时峰形比较稳定，基线很平，峰的数量较多。因此综合考虑谱图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种出芽短梗霉的GC‑MS代谢组学研究的样品处理方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）通过发酵培养获得出芽短梗霉菌体1.1种子培养将出芽短梗霉菌株活化2‑3h，然后用无菌生理盐水洗斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液，按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养；1.2发酵培养 接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；在发酵稳定期即96h、120h、144h的任一时间点进行取样，获得发酵液立即进行处理；（由于进行筛选方法的研究不是机理研究实验，因此，任选一点进行取样即可）；（2）样品制备2.1样品前处理 对不同时间点取得的发酵液进行处理，首先离心（7000r/min，30s），除去发酵液中的CaCO3 ，再次离心（15000r/min，10min），弃上清液获得菌体，然后用预冷的0.9%NaCl 洗菌体两次，将菌体放入液氮中淬灭5‑15min即可进行破壁处理；经过反复多次添加液氮进行研磨，研磨20‑30min，称取研磨后的粉末150mg于1.5mL离心管中用于小分子代谢物的提取，提取时向液氮研磨后的样品加入1mL预冷的70%甲醇，反复冻融三次，冷冻离心（10000r/min，10min），取200μL上清液加入20μL 1mg/mL 的丁二酸作为内标，然后进行冷冻干燥；2.2衍生化将真空冷冻干燥后的样品，加50 μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解样品，置于40℃水浴中，反应90min；加80 μL N‑甲基‑N‑(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均匀，置于40℃水浴中，反应90 min；将衍生后的样品10000 r/min冷冻离心10 min；取上清液200 μL加入进样瓶中，于室温放置2 h，用于GC‑MS检测。...
【技术特征摘要】
1.一种出芽短梗霉的GC-MS代谢组学研究的样品处理方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）通过发酵培养获得出芽短梗霉菌体1.1种子培养将出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用无菌生理盐水洗斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液，按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养；1.2发酵培养接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养；在发酵稳定期即96h、120h、144h的任一时间点进行取样，获得发酵液立即进行处理；（由于进行筛选方法的研究不是机理研究实验，因此，任选一点进行取样即可）；（2）样品制备2.1样品前处理对不同时间点取得的发酵液进行处理，首先离心（7000r/min，30s），除去发酵液中的CaCO3，再次离心（15000r/min，10min），弃上清液获得菌体，然后用预冷的0.9%NaCl洗菌体两次，将菌体放入液氮中淬灭5-15min即可进行破壁处理；经过反复多次添加液氮进行研磨，研磨20-30min，称取研磨后的粉末150mg于1.5mL离心管中用于小分子代谢物的提取，提取时向液氮研磨后的样品加入1mL预冷的70%甲醇，反复冻融三次，冷冻离心（10000r/min，10min），取200μL上清液加入20μL1mg/mL的丁二酸作为内标，然后进行冷冻干燥；2.2衍生化将真空冷冻干燥后的样品，加50μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（20mg/mL），充分溶解样品，置于40℃水浴中，反应90...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，边艳慧，王萌，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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